基于real-time PCR的酿酒葡萄霜霉菌潜伏期田间宏观定量分析

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由葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)侵染引起的葡萄霜霉病是世界范围内葡萄生产中最严重的病害之一,也是宁夏贺兰山东麓地区酿酒葡萄生产中重点防治和监控研究的对象。潜伏期菌量的定量检测是病害进行早期监测预警的关键,但目前有关葡萄霜霉菌潜伏期菌量与田间病害发生的关系仍缺乏系统性研究。因此,本研究通过实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,real-time PCR)潜伏期菌量检测体系的建立、潜伏期分子病情指数(molecular-detected disease index,MDI)和田间病情指数(disease index,DI)的相关性分析、环境因子对潜伏期菌量的影响以及利用Arc GIS技术对潜伏期菌量和田间实际病情的可视化模拟等方法,对酿酒葡萄霜霉病潜伏期开展系统研究,以期为贺兰山东麓地区酿酒葡萄霜霉病早期预警和防治提供理论依据。研究结果如下:1.引物F-g-6/R-g-6和F-cox-Pv/Pv-R在real-time PCR技术下对葡萄叶片DNA和葡萄霜霉菌DNA经梯度稀释准确定量测定的最低检测量分别为0.01 ng·μL-1和0.1 pg·μL-1,均为常规PCR的100倍。建立葡萄叶片DNA和葡萄霜霉菌DNA的标准曲线,分别为y1=26.38-3.06x(R2=0.99598)和y2=18.01-3.60x(R2=0.99297),标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系;利用建立的real-time PCR检测方法对20个田间样品进行检测,共检测到17个样品中含有葡萄霜霉菌,其MDI与DI存在极显著相关性,相关系数为0.902。建立的MDI检测方法,可用于检测葡萄霜霉病菌的潜伏期菌量。2.立兰酒庄3个样地的MDI和DI存在极显著相关性,3个样地MDI均与采样15 d后的DI拟合性最高;当MDI值在0.0035~0.1841之间时,12 d后葡萄霜霉病在果园零星发生。MDI大于0.0035时,可作为当地酿酒葡萄霜霉病防治预警指标。3.在室内可控条件下,葡萄霜霉病接种发病的最佳条件为:温度24℃、湿度95%和叶面湿润时间12 h,赤霞珠和霞多丽的潜育期分别为26.67 h和22.67 h,建立的预测模型分别为YI=3481.917-62.250A-53.108B-27.218C+0.088AB+0.016A C+0.025BC+1.146A 2+0.263B2+0.974C2 和 Y2=3231.667-40.875A-53.783B-23.938C+0.025AB-0.031A C+0.050BC+0.833A2+0.273B2+0.802C2;田间进行潜育期预测模型验证,平均准确率为85.53%;病菌侵入后,温度和接种量对酿酒葡萄霜霉病潜伏期菌量影响较大,接种后相同时间内,随温度的升高,MDI值先升高后降低,温度为24℃时,MDI值达到最高,接种后24 h的MDI值为0.6531;接种后相同时间内,MDI值随接种浓度升高而增大,当接种浓度为1×107个·mL-1时,MDI值最高,接种后24 h的MDI值达到1.1494。在温度和接种量一定条件下,病菌潜伏期MDI值随接种时间的变化关系符合指数函数模型,y=0.1691·e0.0485x(R2=0.9602)。本研究为深入开展田间酿酒葡萄霜霉病早期监测预警与防控提供了参考。4.立兰酒庄3个试验样地的潜伏期菌量和田间发生量均显示出不同的空间结构,其半变异函数为指数模型、高斯模型和球型模型,田间种群的空间格局均为聚集分布,空间变异程度均在45%以下,空间相关范围在55.90~167.49 m之间,可以较好的模拟3个试验样地潜伏期菌量和田间发生量的空间分布,易于确定田间发病中心和发生程度。
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