HCV属于黄病毒家族,基因组为单正链RNA,全长约9.6kb,由5’非翻译区、一个开放阅读框(open reading frame,ORF)、3’非翻译区组成。ORF包含10个基因,编码一条由3010~3030个氨基酸组成的多聚蛋白前体肽链,在宿主细胞和病毒蛋白酶的加工下,产生至少10种成熟的HCV蛋白质,分别是C(core)、E1(envelope 1)、E2、p7、NS2(nonstructural protein 2)、NS3、NS4A、NS4B、NS5A以及NS5B蛋白。近年来发现,C基因区存在一个重叠的替代读码框(alternate reading frame,ARF),编码一种新的HCV病毒蛋白质,命名为F蛋白。F蛋白主要分布在细胞内质网上,半衰期为5~10min,功能尚不清楚。为此,本研究开展了F蛋白原核表达、纯化以及抗原性,F蛋白与细胞凋亡的关系和F蛋白磷酸化对其细胞内分布影响共3方面研究工作,旨在考察F蛋白与HCV致病性的关系,为HCV预防与治疗提供新的理论依据。一、HCV F蛋白表达、纯化以及抗原性首先,我们根据大肠杆菌密码子偏嗜性原则设计了11条引物,应用引物延伸法合成了HCV f基因,以此为模板经PCR扩增得到截短型f65基因片段(219bp)。将f65基因片段定向克隆至pET32a(+),得到pET32a-f65重组子,然后将重组子转化大肠杆菌Plyss菌株,经IPTG诱导后获得分子量约32kDa的HCV F65蛋白。F65蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解液上清中。0.6mM和1mM IPTG诱导产生的可溶性F65蛋白分别为菌体蛋白的33.4%和34.2%。我们采用Ni-NTA树脂纯化可溶性F65蛋白,SDS-PAGE电泳显示不含杂蛋白条带,F65蛋白浓度为38~72μg/ml。WB(Western blotting)证实,纯化的F65蛋白能与His单抗发生结合反应,但不与GFP单抗发生结合反应,说明F65蛋白抗原特异性强。其次,我们以50μg/mL高纯度F65蛋白为包被抗原,采用ELISA法分别检测了正常人、HBV感染者以及HCV感染者(n=30)血清中F抗体。30份正常人血清、乙肝患者血清以及丙肝患者血清平均A450分别为0.044±0.011,0.054±0.023和0.125±0.061,丙肝组与乙肝组差异显著(p﹤0.001)。以正常人血清平均A450值为阴性对照值,根据公式临界值=2.1×阴性对照A450,计算得到临界值为0.092。以0.092为临界值,19份丙肝患者血清F抗体阳性,阳性率为63.3%(19/30);1份乙肝患者血清F抗体阳性,阳性率为3.3%(1/30),可能为HCV混合感染;丙肝患者血清F抗体阳性率显著高于乙肝患者血清(p﹤0.001)。最后,我们应用F65蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆F抗体,再用SPA树脂纯化兔血清中F抗体,获得了纯化的兔源性F多抗。WB证实,F多抗能与HCV F65蛋白发生特异性结合反应,效价为1:30000;但是F多抗与pET32a(+)载体自身蛋白(Trx蛋白)不发生结合反应。本节实验结果表明,HCV F65蛋白具有特异的抗原性,可用来检测血清中F抗体;HCV感染者血清中存在F抗体;兔源性F抗体可用来检测HCV F蛋白。二、HCV f基因稳定转染的HepG2细胞增殖及抗TNF-α诱导的凋亡我们应用脂质体转染法将F蛋白真核表达质粒pcDNA3.1+-f转入HepG2细胞,应用350μg/ml G418筛选得到稳定表达F蛋白的HepG2细胞(Hep-f),以转染空载体pcDNA3.1+的HepG2细胞(Hep-3.1)为对照。WB检测显示,第1代和第10代Hep-f细胞均能表达14kDa左右的F蛋白。其次,我们应用MTT法分别测定Hep-f和Hep-3.1细胞生长情况,结果显示Hep-3.1细胞生长速度落后于Hep-f细胞生长速度(p﹤0.01),说明HCV f基因促进HepG2细胞增殖。分别采用20、40、60、100和200IU/ml TNF-α处理Hep-f和Hep-3.1细胞,然后应用MTT法测定细胞生长情况,结果表明,20~200IU/ml TNF-α对Hep-f和Hep-3.1细胞的生长抑制率分别为4.8~19.4%和8.3~53.1%,前者低于后者(p﹤0.05),提示Hep-f细胞对TNF-α具有一定的抵抗作用。接着,我们应用100IU/ml TNF-α分别处理Hep-f和Hep-3.1细胞,再应用Annexinⅴ/PI双标记流式细胞术测定TNF-α处理18h和36h的细胞凋亡率,每个时间点进行5次独立实验,凋亡率以X±SD来表示,结果为:TNF-α作用18h后,Hep-f和Hep-3.1细胞凋亡率分别为(0.41±0.11)%和(37.43±2.03)%,两者差异显著(p﹤0.001);TNF-α作用36h后,Hep-f和Hep-3.1细胞凋亡率分别为(10.03±0.41)%和(44.63±3.37)%,两者差异显著(p﹤0.001)。同时,我们采用Hochest33342标记后激光共聚焦显微镜观察细胞核形态改变,结果显示:100IU/ml TNF-α作用18h后,Hep-3.1细胞胞核发生固缩、脱落形成凋亡小体等异常改变,Hep-f细胞胞核也出现以上异常改变,但是Hep-3.1细胞胞核发生异常改变的比例高于Hep-f细胞。以上两方面的结果提示,Hep-f细胞可以抵抗TNF-α诱导的凋亡作用。最后,为了探讨Hep-f细胞抗凋亡表型与NF-κB活化的关系,我们应用100IU/ml TNF-α处理Hep-f和Hep-3.1细胞,然后分别于0h、0.5h、1h、2h、18h、36h检测细胞内NF-κB-p65和IκB-α表达量,结果显示:(1)Hep-f细胞内p65总量在6个时间点依次为2.85,2.67,2.61,2.84,2.80,2.69,对照的Hep-3.1细胞则为2.88,2.94,2.86,2.76,2.71,2.50,两种细胞内的p65总量无显著差别(p﹥0.05);(2)Hep-f细胞核内p65含量在6个时间点依次为1.10,3.90,3.92,3.92,2.07,1.67,对照的Hep-3.1细胞则为1.08,2.05,2.04,1.95,1.03,1.10,两种细胞核内的p65含量有显著差别(p﹤0.05),并且,Hep-f细胞核内p65含量变化规律不同于Hep-3.1细胞;Hep-f细胞核内p65变化分为3个阶段: p65急剧上升到处理前水平的3~4倍(0~0.5h期间),p65维持在处理前3~4倍的高峰水平(0.5~2h期间),p65缓慢减少但始终高于处理前水平(2~36h期间);Hep-3.1细胞核内p65变化分为4个阶段: p65急剧上升到处理前水平的1~2倍(0~0.5h期间),p65维持在处理前水平的1~2倍水平(0.5~2h期间),p65含量持续下降至18小时后恢复到处理前水平(2~18h期间),p65维持在处理前水平(18~36h期间)。以上结果提示,Hep-f细胞内NF-κB异常活化,活化强度过高,活化持续时间延长。(3)Hep-f细胞质内IκBα含量在6个时间点依次为0.46,0.37,0.19,0.25,0.32,0.34,对照的Hep-3.1细胞则为0.45,0.39,0.31,0.39,0.5,0.52,两种细胞质内IκBα含量有显著差别(p﹤0.05)。TNF-α处理的Hep-f细胞,细胞质内IκBα含量在0~1h内减少,之后的1~36h内缓慢增加,但始终低于TNF-α处理前水平。TNF-α处理的Hep-3.1细胞,细胞质内IκBα在0~1h内减少,之后的1~2h内缓慢增加,至2h已经接近TNF-α处理前水平,2h~36h内逐渐恢复到处理前水平。我们的结论是,HCV F蛋白引起细胞内NF-κB异常活化,使得稳定转染f基因的HepG2细胞表现出抗凋亡表型。三、HCV F蛋白磷酸化位点突变与细胞内分布关系我们应用NetPhos2.0 Server软件预测F蛋白的磷酸化位点,据此设计重叠引物,应用引物延伸法获得突变型HCV f基因,该基因第13、14、114、121和124位密码子由野生型f基因的TCT突变为GAT,对应氨基酸由丝氨酸(S)突变为天冬氨酸(D)。将突变型f基因及野生型f基因定向克隆至pEGFP-N1,得到pEGFP-mf和pEGFP-f重组子。采用脂质体法将重组子转染HepG2细胞,再用激光共聚焦显微镜观察突变型F蛋白以及野生型F蛋白在细胞内的分布情况,拍照并进行半定量分析。结果显示,在HepG2细胞中,突变型F蛋白主要分布在细胞核内(90%),细胞质内有少量分布(10%),平均荧光强度分别为63.70±3.20和7.06±0.34,统计学上两者差异显著(p<0.001);野生型F蛋白主要分布在细胞质内(94.9%),细胞核内有少量分布(5.1%),平均荧光强度分别为83.34±4.07和4.48±0.22,统计学上两者差异显著(p<0.001)。以上结果提示,HCV F蛋白在细胞内存在磷酸化和非磷酸化2种形式,其功能也不同。细胞质内以磷酸化F蛋白为主,非磷酸化F蛋白主要位于细胞核内。磷酸化F蛋白可能参与HCV病毒复制调节,非磷酸化F蛋白可能影响细胞核内基因转录。