【摘 要】
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研究背景及目的 血管内皮屏障功能不良是动脉粥样硬化发生的关键始动因素。血管内皮通透性是检测内皮屏障功能的计量指标。目前研究证实,外源性刺激包括细胞因子和炎症介
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研究背景及目的 血管内皮屏障功能不良是动脉粥样硬化发生的关键始动因素。血管内皮通透性是检测内皮屏障功能的计量指标。目前研究证实,外源性刺激包括细胞因子和炎症介质等主要是通过引起细胞骨架重构导致内皮通透性增加及内皮功能不良。许多特异性信号分子如RhoA,血清反应因子(SRF)参与了细胞骨架重构的调控。虽然一些特异性基因和信号通路调控多种细胞骨架重构的作用已被证实。但不同外源性刺激作用于血管内皮细胞(ECs)后,细胞内信号分子和信号通路如何相互作用,调控纤维形肌动蛋白(F-actin)重构,并最终引发血管内皮屏障损伤的分子机制仍未完全阐明。本研究旨在深入探讨血清饥饿,TNF-α,LPS和PMA引起ECs F-actin及通透性改变的分子机制。 实验方法 1.探讨RhoA、ROCK和SRF在血清饥饿诱导的HUVECs骨架蛋白和通透性改变中的作用机制。 (1)利用Transwell chamber模型和Rhodamine-Phalloidine染色测定血清饥饿不同时间HUVECs的通透性和F-actin的变化。Western blot检测细胞中活化RhoA及SRF的表达变化。(2)构建表达持续活化型RhoA(pLNCX-L63RhoA)和主导抑制型RhoA(pLNCX-N19RhoA)的重组质粒,磷酸钙共沉淀法转染293细胞后收集病毒上清,感染HUVECs后G418筛选稳定感染的HUVECs,PULL DOWN实验检测感染前后细胞中RhoA活性变化。(3)免疫组化和Western blot分析血清饥饿不同时间的HUVECs、N19RhoA-
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