论文部分内容阅读
背景和目的目前恶性肿瘤已经严重的威胁着我国人民的身体健康,肿瘤治疗的基本手段包括传统的外科手术、放疗和化疗等,治疗效果较为明显。由于放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞,因此对患者本身的损伤亦较大,降低了患者的生活质量,生物治疗目前已经成为传统疗法的必要补充。食管癌是我国华北地区发病率较高的恶性肿瘤,虽然对放疗较为敏感,但是由于其独特的生物学特性,其对化疗的敏感性较低,目前手术仍然是改善患者预后和提高生存率的主要手段。由于恶性肿瘤本身的一些特性即易侵袭和复发,使患者术后5年生存率低于10%,因此寻找新的抗肿瘤方法是近几年来研究的热点之一。近几十年来由于免疫学的发展,人们已经认识到人体自身的免疫系统在抗肿瘤方面发挥的作用。免疫治疗作为一种新的生物治疗手段,在恶性肿瘤的治疗中正在发挥积极的作用。寻找肿瘤特异性抗原和肿瘤相关性抗原对于肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗极为重要。随着对免疫应答分子机制的深入研究,人们认识到机体的免疫细胞并非一一对应于各种抗原,而是针对各种各样抗原分子的抗原表位。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,也是TCR/BCR和抗体特异性结合的基本单位,因而表位在抗原中起着关键性作用。发现一个新的肿瘤抗原表位就有可能研制出针对该抗原的特异性抗体或者是疫苗,现在已经明确,基于被特异性T细胞所识别的肿瘤抗原表位疫苗作为抗肿瘤的新一代疫苗,有着诱人的应用前景,因此发现并鉴定各种抗原来源的T细胞表位已经成为分子免疫学领域的热门课题之一。黑色素瘤抗原(MAGE)是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关性抗原。MAGE在正常组织中(除睾丸和胚胎外)均不表达,主要表达于恶性肿瘤组织中,其表达和肿瘤的发生、发展及预后关系十分密切。研究发现,MAGE基因在多种消化道肿瘤中有不同程度的表达,其基因产物是一种肿瘤排斥抗原,可在肿瘤细胞表面与人类白细胞抗原(HLA)分子结合,由CTL识别,产生特异性效应杀伤肿瘤细胞。MAGE基因家族成员之一MAGE-4在食管鳞癌(74%),肺癌(59%),头颈部肿瘤(53%),膀胱癌(45%)表达程度较高。Zambon等研究发现67%食管鳞癌和37.5%的食管腺癌中至少表达一种MAGE基因,其中MAGE-4更多见于鳞癌组织中,因此MAGE-4可以作为食管鳞状细胞癌的一个特异性指标,寻找MAGE-4 HLA限制性表位,将为食管癌及其它恶性肿瘤的生物治疗提供一定的理论依据。方法1.利用Internet网络进入SYFPEITHI在线预测主页(http://www.syfpeithi.de/scriots/MHCServer.dll/home.htm),点击“Epitope prediction”进入预测界面,选择“HLA-A~*0201”及“HLA-A~*03”分别对目的抗原进行表位预测。选择分值超过20的九肽,运用蛋白酶体裂解基序(Proteasomal cleavage motifs)的预测方案(NetChop3.0)分析工具,以FASTA格式输入目的抗原序列,进行C-端酶切位点分析。然后再利用基于结构的表位预测算法(MHC-Pred)工具进行结构亲和性分析。2.按照标准的Fmoc固相合成方法进行多肽合成,高效液相色谱法(HPLC)纯化合成出的候选肽,电喷雾质谱(ESI-MS)鉴定其分子量。3.RT-PCR法检测MAGE-4的mRNA在三种肿瘤细胞EC-1、EC-109和EC-9706中的表达情况。4.运用T2细胞株结合力实验分析候选肽与HLA-A2/A3分子的结合力。5.选取高结合力的肽诱导出特异性CTL细胞,MTT法检测其杀伤毒性。结果1.综合运用生物信息学方法预测出分值比较高的5条肽作为肿瘤相关抗原肽MAGE-4的候选表位肽。2.标准的Fmoc固相合成法合成筛选出的5条表位肽,HPLC纯化,其纯度大于90%,质谱分析结果显示实际分子量与理论分子量相符。3.RT-PCR检测出3种肿瘤细胞均表达MAGE-4,其中EC-109中MAGE-4的表达量明显弱于EC-1和EC-9706。4.所有候选肽与HLA-A2分子均没有结合力,P22(ALGLVGAQA)与P286(KVLEHVVRV)与HLA-A3有弱结合力(FI=0.81,FI=0.84)。5.P22和P286诱导的特异性CTL对肿瘤细胞EC-1、EC-9706有明显的杀伤活性,P22对肿瘤细胞EC-1、EC-9706的杀伤率分别为55.13±5.07%和62.66±2.49%,P286对肿瘤细胞EC-1、EC-9706的杀伤率分别为59.02±1.83%和62.17±2.82%,而对MAGE-4表达量弱的EC-109杀伤活性较低(P＜0.05)。结论P22(ALGLVGAQA)和P286(KVLEHVVRV)能够成功的诱导出CTL,从而杀伤肿瘤细胞,是一个新的食管癌抗原表位。