研究背景脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是临床上常见的脑卒中亚型,是中老年常发生的急性脑血管病类型,我国人群中脑出血的发病率约为(50.6～80.7)/10万人年,高血压是其最主要的病因。脑出血具有高发病率和高病死率的特点,目前是导致我国城乡居民疾病死亡的首要原因之一。脑出血不仅发病凶险,病情变化快,而且存活病人远期多存在严重的神经和认知功能障碍。目前临床上仍无有效的治疗方法,因而给家庭、社会和国家带来了沉重的精神和经济负担。脑出血介导的脑损伤分为原发性损伤和继发性损伤。基于血肿占位效应介导的原发性脑损伤,外科手术血肿清除曾被认为是一项重要的治疗手段。然而05年Lancet杂志上发表的一项大样本的临床随机双盲对照研究显示,外科手术清除颅内血肿的治疗并不能显著改善脑出血患者的预后。继发性损伤主要是由于血液及其分解代谢产物对脑组织的毒性作用所致。目前研究已证实,脑出血后血肿溶解的分解及代谢产物是导致继发性脑损伤的重要致病因素。其中铁是血肿内红细胞溶解的主要降解产物,在脑出血后伴随的血肿溶解过程脑组织内会出现显著的脑铁沉积(brainiron deposition)现象,引发急性期的脑水肿反应和远期的神经认知功能障碍。以去铁胺(Deferoxamine,DFX)和米诺环素(Minocycline,Mino)为主的降铁治疗可显著减轻脑出血后铁过载(iron overload)引发的脑水肿,减少神经细胞死亡,显著改善后期神经功能障碍。近些年来针对脑出血后血肿溶解介导的脑铁沉积的机制及防治研究已成为该领域的关键问题而备受研究者的高度重视。但目前脑出血后血肿溶解及其介导的脑铁沉积机制仍缺乏深入的研究。脑出血后血肿溶解和吸收的调控机制十分复杂,其病理生理过程主要为血肿内红细胞的自身溶解与小胶质细胞/巨噬细胞对红细胞及其降解产物的吞噬作用。红细胞自身溶解的特征性病理改变为细胞膜通透性改变和细胞形态的变化,而补体系统中膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)的形成和活化是其重要的调控机制。复合物MAC贯穿红细胞膜,成为跨膜亲水性通道而使红细胞膜失去通透屏障作用,红细胞的形态也由正常的双凹圆盘状逐渐转变成圆球形,最终红细胞因渗透压改变而膨胀裂解,释放出血红蛋白等内容物。小胶质细胞/巨噬细胞在出血性脑损伤刺激后可活化并且表达多种表面吞噬受体,介导红细胞或者降解产物的内吞作用。内吞的红细胞和血红蛋白等在细胞内可经酶降解为铁离子,沉积在小胶质细胞/巨噬细胞内,组织学上表现为含铁血黄素沉积,但不引发明显的病理反应。部分细胞外降解产生的铁离子沉积在血肿周边脑组织中形成铁过载,介导一系列包括炎症在内的继发性脑损伤。研究证实干预血肿溶解部分机制后可起到神经保护作用,这是目前脑出血继发性脑损伤的一个潜在的治疗靶点和方向。铁螯合剂去铁胺(DFX)曾被用于治疗急性铁中毒和慢性铁积聚病等症,后被证实其与铁螯合的作用在脑出血后的治疗中具有神经保护作用;而米诺环素(Mino)作为一类四环素的广谱抗生素,也被证实在脑出血的治疗中具有铁螯合剂的作用。但是目前铁螯合剂的治疗对于脑出血后血肿溶解的影响作用和对脑铁沉治疗效果的影像学定量方法仍需要进一步深入的研究。本研究将观察脑出血后的血肿溶解和其介导的脑铁沉积的动态变化过程并研究其潜在作用和机制,同时探索MRI影像学新技术定量测定脑铁沉积含量。此外,进一步研究去铁胺和米诺环素的铁螯合作用对脑出血后血肿溶解和脑铁沉积的影响作用及可能机制。实验方法第一部分1.采用自体动脉血注血法构建脑出血模型,雄性幼猪被随机分为脑出血后4小时组(ICH 4-hour组)、脑出血后1天组(ICH 1-day组)、脑出血后3天组(ICH 3-day组)和脑出血后7天组(ICH 7-day组),通过HE组织染色观察红细胞形态变化和血肿大体观变化,通过Elisa试剂盒检测血肿内部血红蛋白(Hemoglobin,Hb)和MAC的含量。采用Western blot和免疫组织化学染色检测血肿内部红细胞表面受体CD47,小胶质细胞/巨噬细胞表面吞噬受体CD163和血红素加氧酶1(HO-1)的表达。通过HE组织染色和免疫组织化学染色,分析内吞红细胞的小胶质细胞/巨噬细胞、Iba-1阳性细胞、CD163阳性细胞和HO-1阳性细胞的形态特点。2.采用自体动脉血注血法构建脑出血模型,雄性幼猪被随机分为脑出血后生理盐水治疗3天组(ICH + Vehicle 3-day组)、脑出血后DFX治疗3天组(ICH +DFX 3-day组)、脑出血后生理盐水治疗7天组(ICH + Vehicle 7-day组)和脑出血后DFX治疗7天组(ICH + Vehicle 7-day组),通过Elisa试剂盒检测血肿内部Hb和MAC的含量,采用Western blot和免疫组织化学染色检测血肿内部红细胞表面受体CD47,小胶质细胞/巨噬细胞表面吞噬受体CD163和血红素加氧酶1(HO-1)的表达。第二部分1.采用自体动脉血注血法构建脑出血模型,18月龄雄性Fisher大鼠被随机分为假手术组(sham组),脑出血后1天组(ICH 1-day组)、脑出血后3天组(ICH 3-day组)、脑出血后7天组(ICH 7-day组)、脑出血后14天组(ICH 3-day组)和脑出血后28天组(ICH 28-day组),通过MRIR2*Mapping序列扫描,合成脑铁沉积分布图,并与组织切片铁染色图对比;根据铁标准品浓度,定量计算脑铁沉积含量。2.采用自体动脉血注血法构建脑出血模型,18月龄雄性Fisher大鼠被随机分为假手术组(sham组),脑出血生理盐水治疗后7天取材组(ICH + Vehicle 7-day组)、脑出血Mino治疗后7天取材组(ICH + Mino7-day组)、脑出血生理盐水治疗后28天取材组(ICH + Vehicle 28-day组)和脑出血Mino治疗后28天取材组(ICH +Mino 28-day组),通过行为学评分检测神经功能障碍,通过MRI(T2、T2*,R2*Mapping)序列扫描,合成脑铁沉积分布图,定量计算脑铁沉积含量,并测定早期脑肿胀和后期脑萎缩情况。采用Western blot和免疫组织化学染色检测脑组织中铁蛋白Ferritin,HO-1和基底节神经元指标DARPP-32的表达。结果第一部分1.猪脑出血后7天内HE染色大体观显示血肿逐步溶解,血肿腔内红细胞由双凹圆盘状转变为带棘突的不规则状,最后变成圆球状;红细胞直径逐渐缩小,在第3天时达到最小值,维持至第7天。Elisa试剂盒检测结果显示脑出血后7天内血肿腔内部Hb的含量逐渐降低,在第7天达到最小值,MAC含量逐渐升高,在第7天达到最大值,这两个指标均在第3天时变化最明显。脑出血3天后血肿腔边缘可见小胶质细胞/巨噬细胞噬红细胞现象;7天后血肿腔中央出现噬红细胞现象,而血肿腔边缘出现含铁血黄素沉积。Western blot结果显示脑出血后血肿内CD47蛋白水平逐步降低,在第3天减少最明显,至第7天达到最低值。免疫组织化学染色显示CD163阳性细胞和HO-1阳性细胞在脑出血后随时间从血肿腔边缘向血肿腔中央浸润,且血肿内部浸润的CD163阳性细胞和HO-1阳性细胞呈小胶质细胞/巨噬细胞形态。Western blot结果显示脑出血后血肿内HO-1蛋白含量在脑出血后随时间逐步增加。2.猪脑出血后3天,DFX治疗组血肿内Hb含量较生理盐水治疗组升高,MAC含量较生理盐水治疗组降低;猪脑出血后3天和7天,Western blot结果显示DFX治疗组血肿腔内CD47蛋白含量下降较生理盐水治疗组减慢,血肿腔内HO-1蛋白含量较生理盐水治疗组减少。免疫组织化学染色结果显示DFX治疗组血肿腔内浸润的CD163阳性细胞数和HO-1阳性细胞数较生理盐水治疗组减少。第二部分1.MRIR2*Mapping检测老年大鼠脑出血模型结果显示脑出血后血肿周边脑铁沉积含量较对侧半球相同部位明显升高,且脑铁含量在脑出血后随时间逐步升高,至14天到达最高值,维持至28天。组织Perls’染色提示铁染色阳线区域与R2*Mapping合成图高信号区域大致相同。2.MRI检查结果显示Mino治疗减轻了脑出血后3天的脑肿胀程度;在脑出血后7天和28天,Mino治疗降低了血肿周边脑铁沉积含量,缩小了 T2*相损伤体积;Mino治疗缓解了脑出血后28天损伤侧半球的脑萎缩程度。Western blot和免疫组织化学染色结果显示Mino治疗降低了脑出血后7天HO-1的蛋白水平,减缓了 DARPP-32蛋白表达水平的降低;Mino治疗减少了脑出血后7天和28天的Ferritin的蛋白表达水平。行为学检测结果提示Mino治疗改善了脑出血后7天和28天的神经功能缺陷。结论第一部分1.猪脑出血后血肿随时间逐步溶解,血肿内部Hb的含量逐渐下降,在脑出血后第3天最明显;该过程的发生一方面与红细胞自溶相关,红细胞形态和直径的变化可能与补体系统中MAC含量逐步上升有关;另一方面与噬红细胞作用相关,小胶质细胞/巨噬细胞吞噬红细胞现象的发生和CD163、HO-1阳性细胞向血肿腔内部的浸润可能与血肿内部红细胞表面受体CD47降解有关。2.DFX治疗在脑出血后减慢Hb降解,减少MAC含量,抑制CD47蛋白降解,下调CD163阳性细胞和HO-1阳性细胞数量。DFX治疗减慢血肿溶解的过程可能与减少红细胞自溶和抑制小胶质细胞/巨噬细胞吞噬红细胞作用相关。第二部分1.老年大鼠脑出血后血肿周边脑铁沉积含量逐步增加。MRIR2*Mapping是无创性定量测定脑铁沉积含量的可靠新方法。2.Mino治疗减少了脑出血后血肿周边脑铁沉积的含量,降低了 Ferritin、HO-1等铁代谢相关蛋白的表达水平;Mino治疗减轻了脑出血后早期脑肿胀程度,减少了基底节神经元死亡,缓解了后期脑萎缩情况,促进了神经功能恢复。Mino治疗减轻脑出血后继发性脑损伤可能与减少血肿溶解后脑铁沉积含量相关。