荧光性假单胞菌泛指在KB培养基上能够产生荧光素,经366nm紫外线照射发荧光的假单胞菌,如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等,它们属于丙型变形菌纲假单胞菌属,革兰氏阴性细菌,在土壤、水、植物表面、动物体内等环境中广泛分布。荧光性假单胞菌是一类重要的功能菌,能产生多种抗生性次级代谢产物如氢氰酸、藤黄绿脓菌素、2,4-二乙酰基藤黄酚、硝吡咯菌素、吩嗪类及脂肽等,对多种病原菌具有较好的抑制效果,在生物降解、食品加工、药物配方和生防等领域有广泛的应用前景。本文从病害烟草根际土壤中筛选到一株产表面活性剂的菌株G4,它对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)等病原菌具有较好的抑制作用。G4对病原菌良好的生物抑制活性,促使我们对该菌株及其活性代谢产物进行了初步研究,主要研究内容及结果如下:(1)利用KB鉴别培养基从烟草、甘蓝、油麦菜、生菜、韭菜、黄瓜等根际土壤分离筛选到426株荧光性假单胞菌;进一步通过扩油圈实验筛选出51株排油活性较好的菌株;对51株菌进行真菌拮抗实验、细菌抑制实验和代谢产物液相分类实验,最终筛选到一株能够抑制金黄色葡萄球菌、玫瑰色红球菌、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)等病原菌且代谢物分类独立的菌株G4作为后续研究的实验菌株。(2)运用多相分类法对菌株G4进行了鉴定。16SrDNA序列分析表明菌株G4分别与假单胞菌(Pseudomonas koreensis Ps 9-14(T))和假单胞菌(Pseudomonas helmanticensis OHA11(T))同源性最高;rpoB序列分析表明菌株G4与假单胞菌(Pseudomonas sp.46-1)和假单胞菌(Pseudomonas sp.46-2)的相似度最高;脂肪酸成分分析表明菌株G4细胞内脂肪酸主要成分为C16:O(含量为33.99%),经MIDI数据库比对,菌株G4与绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens)和桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)相似度最高(SI=0.718);测试41项生理生化特征,结果显示菌株G4的大部分理化性质与荧光假单胞菌标准菌株一致,但个别有不同;进一步结合菌株G4的形态特征(菌落、革兰氏染色、扫描电镜),将本次筛选到的菌株G4确定为假单胞菌,命名为假单胞菌G4(Pseudomonas sp.G4)。(3)对假单胞菌G4可能产生的抗生性次级代谢产物进行了预测和分析,以期能够为后续活性物质分离纯化方法的选择及活性产物结构的确定提供更多的途径。利用PCR技术扩增假单胞菌产生的常见抗生性次级代谢物Plt,Prn,Pca,Phl的相关合成基因及NRPS和PKS的功能基因,结果表明菌株G4可能至少拥有两套NRPS和一套PKS生物合成基因簇;利用不同的检测方法检测了假单胞菌产生的一些常见抗生性次级代谢物,如磷脂、糖脂、脂肽、嗜铁素等,薄层显色结果表明菌株G4能够产生脂肽类物质,同时还检测到菌株G4能够产生一种挥发性的抗生素-氢氰酸。(4)提取菌株G4(LD液体培养基发酵培养)发酵上清液酸沉淀物,通过薄层色谱确定硅胶柱分离条件,利用活性追踪的方法,采用硅胶柱层析对粗提物进行初步分离,滤纸片扩散法测试确定组分二和三对指示菌具有较好的抑制作用,而组分一无抑制效果,但组分二量太少,达不到做制备的要求,因此,通过制备型HPLC进一步对组分三进行分离收集,活性跟踪,确定了 3个活性组分,命名为Z2、Z4和Z5。质谱分析初步得到Z2分子量为506.3 Da;Z4组分中有两种物质,分子量分别为562.3 Da和592.3 Da,且具有排油活性,推测Z4组分可能为两种肽类表面活性剂的混合物,与基因层面的预测结果“可能至少存在两套NRPS生物合成基因簇”吻合;Z5组分的分子量为319.1 Da,进一步通过薄层显色及理化性质推测其可能为假单胞菌产生的一种活性物质冠菌素。(5)选取实验室保藏的30株临床致病金黄色葡萄球菌和6株病原菌,对Z2、Z4和Z5的抑菌活性进行了初步评价,抑菌实验表明Z2对粪嗜冷杆菌(Psychrobacter faecalis)和藤黄微球菌等具有一定的抑制效果,但对临床致病金黄色葡萄球菌几乎无抑制效果,而Z4和Z5的抑菌谱相对广一些,对大部分临床致病的金黄色葡萄球菌以及玫瑰色红球菌等都具有抑制作用。菌株G4能够产生表面活性剂、氢氰酸和其他的一些抗生性次级代谢物,其较好的生物活性在生物降解、食品药品加工、生物防治和治疗领域方面具有潜在应用价值。后续将继续优化发酵条件,提高产量,并进一步优化液相分离条件以获得足够量且纯度较好的样品进行活性物质的结构解析。