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背景和目的:肺癌是最为常见的肿瘤并且是引起全球肿瘤相关死亡的重要原因,其中非小细胞肺癌（non-small lung cancer,NSCLC）为肺癌的主要类型之一,约占85%。根据2020年全球癌症数据,肺癌的死亡率仍居首位,高达18%。尽管临床上对肺癌患者的治疗大有改善,但全球范围内非小细胞肺癌患者的5年存活率仅有5%左右。因此,探索非小细胞肺癌潜在治疗靶点具有重要意义。丝氨酸是癌细胞利用最多的氨基酸之一,仅次于谷氨酰胺。作为胞内一碳单位的重要来源,丝氨酸在核苷酸、ATP、SAM、NAPDH的合成中发挥重要作用。丝氨酸的合成需要三种酶的参与,即磷酸甘油脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase,PHGDH）、磷酸丝氨酸氨基转移酶1（phosphoserine aminotransferase,PSAT1）和磷酸丝氨酸磷酸酶（phosphoserine phosphatase,PSPH）,其中PSPH作为丝氨酸合成最后一步的关键酶催化3-磷酸丝氨酸转变成丝氨酸。目前,PSPH在肿瘤方面的研究甚少,其在肿瘤中维持蛋白稳态的分子机制尚未见报道。本课题研究旨在探究非小细胞肺癌中的PSPH维持蛋白稳态的分子机制,阐明PSPH在非小细胞肺癌中的作用。该研究主要分为三部分,第一部分:明确PSPH在非小细胞肺癌增殖及迁移中的作用;第二部分:寻找调控PSPH蛋白稳态的分子机制;第三部分:寻找调控PSPH蛋白稳态的关键位点,明确该位点对细胞增殖和迁移的作用。本研究的发现为以PSPH为靶点开发新型抗癌药物夯实了理论基础。第一部分PSPH促进NSCLC细胞增殖和迁移研究方法:1、通过TCGA数据库分析PSPH在LUAD和LUSC中的表达情况及与生存率的相关性。2、收集非小细胞肺癌患者的癌组织和癌旁组织,通过Western blot检测PSPH在蛋白水平的表达;培养正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）和非小细胞肺癌细胞（A549、H1299、PC9、H358、HCC827、H292）,通过Western blot和q-PCR检测PSPH在蛋白水平和m RNA水平的表达。3、用特异性si RNA敲低非小细胞肺癌细胞中PSPH的表达,通过增殖实验、划痕实验以及transwell实验来检测PSPH对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移的影响。结果:1、在TCGA数据库中,PSPH在非小细胞肺癌癌组织中的表达均高于癌旁组织;在LUAD中,PSPH高表达显著降低患者存活率,而在LUSC中,PSPH高表达对患者存活率无显著影响。2、在组织水平上,PSPH在非小细胞肺癌癌组织中的蛋白表达显著高于癌旁组织;在细胞水平上,6株非小细胞肺癌细胞中PSPH的蛋白及m RNA表达均显著高于支气管上皮细胞。3、敲低PSPH的表达显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移。第二部分STUB1促进PSPH蛋白的泛素化降解研究方法:1、用放线菌酮CHX分别处理BEAS-2B细胞及A549细胞,在不同时间点收样,通过Western blot检测PSPH的蛋白降解速率;同时,用CHX联合蛋白酶体降解途径抑制剂MG132或联合溶酶体降解途径抑制剂CQ处理,通过蛋白表达回复情况来明确PSPH的降解途径。2、运用免疫共沉淀技术检测PSPH与STUB1之间的相互结合;通过免疫荧光实验检测PSPH和STUB1在细胞中是否存在共定位。3、在A549细胞中过表达或敲低STUB1,通过q-PCR及Western blot检测PSPH的m RNA与蛋白表达水平、蛋白降解速率及泛素化修饰水平。结果:1、A549细胞中PSPH的降解速率显著慢于BEAS-2B,并且A549细胞中PSPH蛋白表达经MG132和CQ处理均有回复,而MG132处理组的PSPH回复更显著;同时,MG132处理显著上调PSPH泛素化水平,而CQ处理后泛素化水平并无显著改变。2、免疫共沉淀显示STUB1与PSPH存在相互结合;荧光共定位实验表明STUB1与PSPH之间存在共定位。3、A549细胞中过表达STUB1显著下调PSPH蛋白的表达,加快PSPH降解速率,但对PSPH的m RNA水平无显著影响。4、STUB1促进PSPH的K48型泛素化修饰,但不影响其K63型泛素化修饰。第三部分PSPH第158位赖氨酸为调控其降解的关键泛素化位点,抑制该位点泛素化促进肿瘤增殖和迁移研究方法:1、A549分别转染野生型PSPH和突变型PSPH-K158R,检测其蛋白泛素化水平及蛋白降解速率。2、构建过表达野生型PSPH和突变型PSPH-K158R的稳定细胞系,通过克隆集落形成实验和transwell实验检测细胞增殖和迁移情况。结果:1、与野生型PSPH相比,突变型PSPH-K158R泛素化水平显著降低且蛋白降解速率显著减慢。2、突变型PSPH-K158R细胞的增殖能力及迁移能力显著更强。文章结论:1、PSPH促进非小细胞肺癌的增殖和迁移。2、STUB1泛素化PSPH并促进其蛋白降解。3、抑制PSPH-K158R泛素化促进非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移。