子宫内膜癌是发生在子宫内膜的上皮性恶性肿瘤,以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见,2011年全球癌症统计数据表明子宫内膜癌已成为全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤,并且随着人口老龄化、肥胖及激素替代疗法的应用,其发病率及死亡率的增加趋势更加显著,但其病因学机制尚未完全阐明。随着分子生物学和免疫学的发展,源自肿瘤组织的肽类物质的表达及分泌日益引起人们的关注,P物质(Substance P,SP)因其广泛分布于人体各个组织而成为研究的热点。SP是由11个氨基酸残基组成的神经多肽,由Tac-1基因编码,属速激肽家族,其最初是作为神经递质及疼痛递质而被人们熟悉,具有多种生物学活性:参与疼痛的传递,引起胃肠道平滑肌收缩,调节炎症和免疫反应;在中枢神经系统中作为神经递质或调节递质,调节情感和行为,阻断其受体后可起到止痛、止吐、抗抑郁和抗焦虑的作用。近年来,一些研究结果显示SP在肿瘤的发展过程中也起到调节作用,其在多种肿瘤组织中高表达,能够增加肿瘤组织中神经纤维的数量,增强肿瘤组织中的信号传递,有助于肿瘤的生长及转移;其可引起肿瘤细胞有丝分裂增加、使肿瘤细胞免于凋亡以及调节肿瘤细胞的迁移(包括侵袭、浸润及转移);其还在肿瘤内血管内皮细胞及癌灶旁血管内皮细胞表达,可刺激肿瘤血管生成,通过增加对肿瘤组织的血供来促进肿瘤增长及转移。SP受体包括神经激肽1(neurokinin 1,NK-1)、神经激肽2(neurokinin2,NK-2)及神经激肽3(neurokinin 3,NK-3),但SP主要与NK-1结合而发挥生物学作用。NK-1属G蛋白偶联受体,其与SP结合后可引起磷酸肌醇水解、钙离子内流及丝裂原激活蛋白激酶被激活,从而促使肿瘤细胞增殖、分化、血管形成及转移;国内外报道中提出高选择性NK-1受体拮抗剂L-733,060可以明显抑制肿瘤细胞的生长,促进癌细胞的凋亡,而这些功能主要是依靠抑制SP而发挥作用。但是目前对于SP在子宫内膜腺癌组织中的表达特点及其与临床病理特征的关系尚不清楚,SP以及NK-1受体拮抗剂对子宫内膜腺癌细胞增殖和侵袭的影响也尚无报道。因此,本研究通过免疫组织化学染色法、real-timepcr、western-blot方法观察sp在子宫内膜腺癌组织中的表达情况并分析其与临床病理特征的关系,采用mtt、transwell、real-timepcr、western-blot、elisa技术研究sp及nk-1受体拮抗剂对子宫内膜腺癌ishikawa细胞增殖、侵袭以及vegf-c、mmp-9表达的影响,以阐明p物质在子宫内膜腺癌发生发展中的作用及机制。第一部分p物质在子宫内膜腺癌中的表达及意义目的:探讨p物质在子宫内膜腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:选取2014.1-2014.3在河北医科大学第四医院术前未经任何治疗的子宫内膜腺癌患者15例及同期行子宫全切术且病理证实无子宫内膜病变者10例作为研究对象,采用real-timepcr及western-blot方法比较sp在正常子宫内膜及子宫内膜腺癌组织中表达的差异。选取2014.4-2014.12在河北医科大学第四医院住院手术治疗的子宫内膜腺癌患者56例为实验组,其中figoⅠ期28例,Ⅱ期7例,Ⅲ期21例;组织学分级按照who标准:高分化(g1)17例,中分化(g2)21例,低分化(g3)18例;浸润肌层<1/234例,≥1/222例;淋巴结转移39例,无转移17例;取同期19例行子宫全切术且病理证实无子宫内膜病变者为对照组,采用免疫组织化学染色检测sp的表达,分析sp表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系。结果:1real-timepcr结果显示spmrna在子宫内膜腺癌组织及正常组织中的相对表达量分别为2.624±0.134、1.015±0.021,两组比较有统计学差异(p<0.001);western-blot结果显示sp蛋白在子宫内膜腺癌组织的相对表达量为1.062±0.094,明显高于正常组织中的0.820±0.060(p<0.05);2sp表达于子宫内膜腺癌细胞的胞质及部分胞膜,56例组织标本中阳性表达率为67.86%;其在正常子宫内膜细胞中甚少表达,偶表达于细胞的胞质,阳性表达率为21.05%,两组比较有统计学差异(p<0.001);3sp在子宫内膜腺癌不同的组织学分级(g1、g2及g3)中阳性表达率分别为52.94%、71.73%及77.77%,三组之间比较无统计学差异(p>0.05);在肌层浸润深度<1/2及≥1/2组中sp阳性表达率分别为64.51%和72.72%,两组比较差异无统计学意义(p>0.05);sp在Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ-Ⅳ期子宫内膜腺癌患者中阳性表达率分别为53.57%、71.43%及85.71%,三组间有统计学差异(p<0.05),但组间比较仅Ⅰ期与Ⅲ-Ⅳ期患者有统计学差异(p<0.05);在淋巴结转移及无淋巴结转移组sp表达阳性率分别为47.06%和76.92%,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:p物质在子宫内膜腺癌组织中高表达,并且与淋巴结转移有关,说明神经内分泌机制参与了子宫内膜腺癌的发生、发展过程,为子宫内膜癌发病机制的研究提供了新的理论依据,而p物质也有望成为子宫内膜腺癌判断预后及随访的新指标。第二部分p物质对子宫内膜腺癌ishikawa细胞增殖和侵袭的影响目的:探讨p物质对子宫内膜腺癌ishikawa细胞增殖和侵袭的影响及作用机制。方法:利用real-timepcr及western-blot的方法检测ishikawa细胞株中sp及其受体nk-1的表达;向ishikawa培养液中加入不同浓度的sp,采用mtt法检测sp促细胞增殖的作用,利用transwell小室检测其对细胞侵袭能力的影响;向ishikawa细胞培养液中加入nk-1受体拮抗剂l-733,060,再与sp共培养,观察sp促细胞增殖及侵袭作用的变化。结果:1子宫内膜腺癌ishikawa细胞及正常组织中spmrna的相对表达量分别为3.645±0.275和1.020±0.025;nk-1mrna的相对表达量分别为4.238±0.474和1.030±0.042。子宫内膜腺癌ishikawa细胞中sp及nk-1的表达均明显高于正常组织(p<0.001);2子宫内膜腺癌ishikawa细胞及正常组织中sp蛋白的相对表达量分别为1.198±0.110和0.869±0.067;nk-1蛋白的相对表达量分别为1.251±0.116和0.919±0.040。子宫内膜腺癌ishikawa细胞中sp及nk-1的表达均明显高于正常组织(p<0.01);3向ishikawa细胞中加入sp培养48小时后,与空白对照组相比,sp有明显的促细胞增殖作用(p<0.001);当sp在10-9mol/l~10-7mol/l时,随着sp浓度的增加,细胞增殖能力逐渐增强(p<0.05);但当sp增加到10-6mol/l时,细胞增殖能力有所下降。将不同浓度nk-1受体阻滞剂l-733,060(0,5,10,20and40μmol/l)与ishikawa细胞预培养后再加入10-7mol/lsp培养48h后,与空白对照组相比,5μmol/l组无明显抑增殖作用(p>0.05),其他各组细胞增殖率均随l-733,060的浓度增加逐渐降低(p<0.05),而20μmol/l与40μmol/l组相比差异无统计学意义(p>0.05)。4在侵袭实验中实验组sp浓度选取10-9mol/l~10-7mol/l,与ishikawa细胞共培养48小时后,各实验组肿瘤细胞穿过基底胶的数量明显高于空白对照组(p<0.01);选取sp浓度为10-7mol/l及l-733,060浓度20μmol/l进行transwell小室实验,结果显示ishikawa细胞侵袭能力明显低于10-7mol/lsp组(p<0.01)。结论:p物质可明显促进子宫内膜腺癌细胞的增殖及侵袭,并且nk-1受体拮抗剂可明显抑制其这一能力,说明p物质对子宫内膜腺癌的促增长作用主要是通过与nk-1受体结合而产生的,为子宫内膜腺癌的治疗提供了新的靶点。第三部分p物质对ishikawa细胞vegf-c和mmp-9表达的影响目的:检测p物质及其受体拮抗剂对子宫内膜腺癌ishikawa细胞血管内皮生长因子c(vascularendothelialgrowthfactorc,vegf-c)及基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9,mmp-9)表达的影响,探讨p物质促进子宫内膜腺癌侵袭及转移的机制。方法:向ishikawa培养液中加入不同浓度的sp,利用real-timepcr及western-blot的方法检测ishikawa细胞中vegf-c及mmp-9表达的变化;采用elisa法检测不同组别细胞培养上清中vegf-c及mmp-9的含量。向ishikawa细胞培养液中加入nk-1受体阻滞剂l-733,060,再与sp共培养,利用real-time及western-blot检测vegf-c及mmp-9的表达;采用elisa法检测不同组别细胞培养上清中vegf-c及mmp-9的含量。结果:1不同浓度sp(10-9mol/l、10-8mol/l及10-7mol/l)作用于ishikawa细胞48h后,vegf-cmrna的相对表达量分别为2.133±0.133、2.533±0.191、2.9455±0.287;mmp-9mrna的相对表达量分别为2.035±0.160、2.450±0.205、3.045±0.258,两者均明显高于空白对照的1.050±0.053和1.020±0.028(p<0.001)。10-7mol/lsp+20μmol/ll-733,060组vegf-cmrna及mmp-9mrna的相对表达量分别为1.465±0.108和1.483±0.184,均明显低于10-7mol/L SP组(P<0.001)。2空白对照、10-9mol/L SP、10-8mol/L SP及10-7mol/L SP组VEGF-C蛋白的相对表达量分别为0.953±0.03、1.130±0.365、1.235±0.420、1.343±0.512;MMP-9蛋白的相对表达量分别为0.913±0.038、1.228±0.046、1.350±0.063、1.553±0.120,各实验组VEGF-C和MMP-9的表达均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.001);10-7mol/L SP+20μmol/L L-733,060组VEGF-C及MMP-9蛋白相对表达量分别为0.840±0.036和0.855±0.029,均明显低于10-7mol/L SP组(P<0.01)。3空白对照和各实验组(10-9mol/L、10-8mol/L及10-7mol/L)培养上清液中VEGF-C的含量分别为847.813±28.311、1144.897±38.955、1555.823±56.472、2151.397±79.277;MMP-9含量分别为84.683±5.073、125.327±13.701、177.087±23.033、250.567±31.480,各实验组VEGF-C和MMP-9的含量均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.001);10-7mol/L SP+20μmol/L L-733,060组VEGF-C及MMP-9含量分别为955.933±31.062及96.663±7.02,均明显低于10-7mol/L SP组(P<0.01)。结论:P物质可上调子宫内膜腺癌细胞中VEGF-C和MMP-9的表达,而NK-1受体拮抗剂可抑制其这一功能,说明SP/NK-1系统可通过刺激VEGF-C的表达而促进肿瘤淋巴管形成,也可通过诱导MMP-9表达增多而促进肿瘤细胞的侵袭,进一步阐明了该系统促进肿瘤侵袭和转移的分子机制,为恶性肿瘤尤其是晚期或复发患者的生物治疗提供了新的途径。