背景及目的:重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）载体因具有表达转基因时间持久、安全性高等特点,已成为基因治疗领域的主要治疗载体。然而在生产和临床应用中,发现rAAV载体仍存在包装效率低、稳定性差及转导效率低等一系列问题。在rAAV载体基因组两端存在的反向末端重复序列（inverted terminal repeat,ITR）是唯一保留的野生型AAV基因序列,学界普遍认为其中的D序列对AAV及rAAV载体基因组的复制、拯救、包装均具有重要作用,但因其构型复杂,该结构如何参与功能调控尚待明确。因此本研究主要考察D序列结构如何调控rAAV载体的包装及转导效率,以便为rAAV载体的进一步优化奠定理论基础。方法:本研究主要分为两部分。第一部分是研究D序列及结构改造对rAAV载体包装效率的影响。首先构建三种不同的D序列文库,以文库替换rAAV包装质粒ITR中的D序列及相关序列,并对其中能够包装与转导的序列进行测序,从测序结果中筛选出替代序列进行D序列改造。其次,通过Southern blot和实时荧光定量PCR,考察D序列结构改造对rAAV载体复制和包装效率的影响。第二部分是研究D序列及突变体对rAAV载体表达效率的影响。通过萤火虫荧光素酶报告基因检测,评价D序列结构改造对rAAV载体对不同细胞系的转导效率。结果:（1）通过D序列文库筛选可以得到包装效率优于野生型D序列的替代序列,其中D08127和D24081在自身互补型rAAV载体中分别提高了39.13%和34.24%,D24054和S sequence在单链rAAV载体中分别提高了259.49%和202.82%;（2）rAAV的包装效率与rAAV的复制效率正相关;（3）质粒骨架伪D序列是造成rAAV包装中质粒序列污染来源的原因之一,包装进rAAV载体衣壳的基因组中的质粒DNA占比约为10%;（4）通过D序列改造可以提高rAAV载体的转导效率。在自身互补型rAAV中,D24058在h CMEC/D3细胞中提高了83.74%,D08010在NCI-H446细胞中提高了76.25%,而D18119在LO2和He La细胞中分别提高了41.35%和33.49%。在单链rAAV中,D08121在LO2细胞中提高了147.05%,而D08009在NCI-H446细胞中提高了91.20%。结论:在rAAV载体基因组中不可或缺的ITR结构中的D序列,对rAAV载体的包装及转导具有重要作用。通过D序列的改造可以有效提高rAAV的包装和转导效率。伪D序列的存在是形成rAAV载体中质粒骨架污染的原因之一。本文研究为进一步优化rAAV载体的设计、检测和应用奠定了基础。