骨髓间充质干细胞（bone marrow messenchymal stem cells, MSCs）是骨髓中除了造血干细胞外的另一种成体干细胞。MSCs不仅在体外可培养无限扩增而不丧失其多向分化潜能[1],并且具有支持造血及免疫调节的功能[2],被越来越多地应用于血液肿瘤等恶性疾病的治疗,同时在再生医学及组织工程中也有广泛应用前景。目前应用于临床的或者进行临床试验的骨髓MSCs包括异基因骨髓MSCs及自体骨髓MSCs。然而,研究发现异基因骨髓MSCs归巢困难[3],而自体的MSCs可有效归巢且自体的MSCs安全性高[4],经自体MSCs输注感染传染病的机会少,因此人们也把更多的注意力放在自体的骨髓MSCs身上。对于白血病儿童来说,临床应用的自体MSCs都是在白血病状态下采集,这种异常状态下的骨髓MSCs回输是否安全呢?吴丽萍等人的研究结果表明[5],白血病患儿的骨髓MSCs在生物学特性方面与其他来源的骨髓MSCs无明显差异。但是白血病儿童骨髓MSCs在分子水平及功能学上是否有改变是值得深入研究的。尤其是在功能学上的研究不可忽视,例如:白血病儿童骨髓MSCs是否会有恶性选择及促进白血病复发的作用呢?是否会减弱NK、T细胞等免疫因子的GVL效应及清除MRD的能力而增加白血病的复发率?这些疑问的解决是白血病儿童自体骨髓MSCs安全应用的前提。NK细胞作为机体天然免疫的重要组成部分,是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解,NK细胞在造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继性免疫治疗方面的作用倍受关注。然而,原始来源的NK细胞含量少（外周血约占淋巴细胞的5%-7%）,且目前尚缺乏有效的体外扩增体系,所以NK细胞的广泛临床应用受到了限制。因此,探索NK细胞的体外高效扩增体系具有重要意义。目前研究认为,MSCs细胞具有免疫调节功能;有研究[6-8]发现MSCs细胞能够抑制异体抗原或丝裂原刺激的T淋巴细胞的增殖。但MSCs对T细胞的这种免疫抑制作用机制仍然未明。NK细胞是固有免疫的主要效应细胞,在抗肿瘤抗病毒感染中也同T细胞一样发挥着举足轻重的作用。目前研究认为MSCs对异体抗原或丝裂原刺激的T淋巴细胞起到免疫抑制的作用,那么,MSCs对NK细胞是否也有相似的影响呢?如果不是,MSCs对NK细胞的作用又如何呢?目前这方面的研究相关文献的报道不多,尤其是有关白血病儿童骨髓MSCs更鲜有报道。因此,带着这些疑问,我们在本课题组之前对白血病儿童骨髓MSCs细胞的生物学特性初步研究的基础上,分离纯化扩增脐血NK细胞,并采用NOD/SCID小鼠建立白血病模型,对白血病儿童骨髓MSCs与NK细胞的相互作用及对白血病细胞K562的影响进行体内外的初步研究,为急性白血病儿童骨髓MSCs及脐血NK细胞在白血病免疫治疗中应用的后续研究做前哨性的探索。目的:探讨从人脐血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术、扩增前后其功能的变化;以及在本课题组前期研究急性白血病儿童骨髓MSCs的生物学特性的基础上,探讨急性白血病儿童骨髓MSCs与脐血NK细胞在体外的可能相互作用。同时采用NOD/SCID小鼠建立荷K562白血病模型,探索急性白血病儿童骨髓MSCs在体内对K562肿瘤细胞生长的影响及对NK细胞抗瘤作用的影响。本研究旨在为儿童白血病综合治疗中应用自体MSCs或者联合应用NK细胞清除MRD的潜在应用价值做基础性的探索。方法:先用miniMACS及阳性免疫磁珠分选方法,从脐血单个核细胞（CB-MNCs）得到纯化的NK细胞,随后通过IL-2、IL-12和IL-15三个细胞因子的不同组合将培养体系分为IL-2组、IL-2+IL-l2组、IL-2+IL-l5组、IL-12+IL-l5组、IL-2+IL-l5+Il-l2组及对照组（不加任何细胞因子）,分别培养15天,每3天半量换液并补充细胞因子;检测分选及扩增前后CD3^-CD56⁺+16⁺NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞对K562杀伤率的变化。参照吴丽萍等人[5]的方法,通过Ficoll-Hypaque梯度密度离心法结合贴壁培养法体外纯化扩增急性白血病儿童骨髓MSCs,并进行形态学、免疫表型及多向分化能力的鉴定;取P₃细胞用于后续研究。随后按照不同的MSCs︰NK比例,采用直接接触共培养及Transwell培养两种体系进行急性白血病儿童骨髓MSCs与脐血NK细胞的相互作用体外研究。出于偶然的发现,其中在MSCs︰NK比例相同的条件下,均设置了对应的IL2预先处理MSCs的实验组。两者相互作用7天后的检测指标有:细胞形态、NK细胞增殖率、对K562细胞的杀伤活性及细胞因子分泌水平,检测方法主要采用CCK-8试剂盒及ELISA。最后,采用NOD/SCID小鼠,先腹腔注射环磷酰胺预处理24小时后,尾静脉输注K562细胞或同时K562细胞与MSCs联合输注建立白血病模型;2周左右白血病小鼠出现症状后给予尾静脉输注NK细胞或者联合输注MSCs与NK细胞;从生存期分析、病理检查等方面研究急性白血病儿童骨髓MSCs在实验动物体内对K562肿瘤细胞生长的影响及对脐血NK细胞抗瘤作用的影响。结果:纯化前,流式细胞术检测CB-MNC中CD3-CD56++16+细胞含量为14.85±9.1,免疫磁珠纯化后,CD3-CD56++16+细胞含量为92.1±1.1;脐血中的NK细胞含量由纯化前的14.85±9.1%提高到92.1±1.1%,每份标本分离得到的NK细胞纯度均>90%。扩增培养期内台盼蓝染色示细胞存活率均为95%以上。培养前5天,各组细胞增殖均较缓慢;最快增殖时间出现在培养第2周,即第7-15天,此阶段各组培养条件下NK细胞均较培养初期显著扩增。培养至第15天IL-2组、IL-2+IL-12组、IL-2+IL-15组、IL-15+IL-l2组、IL-2+IL-15+IL-l2组NK细胞的扩增倍数分别为15.51±1.09,24.01±3.81,51.45±4.36,20.01±3.88及53.34±6.76,均显著高于对照组的1.64±1.0（p﹤0.01）,IL-2+IL-15组、IL-2+IL-15+IL-l2组细胞的扩增倍数显著高于IL-2组、IL-15+IL-l2组及IL-2+IL-12组（p﹤0.01）。其中对照组NK细胞在培养第15天细胞数较前下降,显微镜下观察可见细胞状态差,死亡细胞增多。各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强（p<0.01）,NK细胞对K562杀伤活性呈IL-2+IL-15组>IL-2+IL-12组>IL-15+IL-l2组>IL-2组,且IL-2+IL-15组与IL-2+IL-15+IL-l2组差异无统计学意义（p>0.05）。。随着效靶比从1︰1、5︰1到10︰1,各组NK细胞对K562细胞的杀伤率均逐步提高（p<0.01）。培养的白血病儿童BM-MSCs在光镜下观察,呈梭形,平行排列漩涡状生长;不表达造血细胞相关抗原CD34、CD45,而CD29、CD105及CD13则阳性表达;在相应的诱导体系下,该MSCs可以向脂肪及骨细胞分化,油红O染色及西素红染色阳性。MSCs与NK细胞共培养的实验结果显示,MSCs抑制NK细胞的增殖,其抑制作用呈剂量依赖性,但IL2预先刺激24小时的MSCs细胞对NK细胞增殖的抑制作用明显减低,当MSCs︰NK比例为1︰100时,这种抑制作用基本消失;在直接相互接触共培养及Transwell培养体系中均观察到这种相同现象,但Transwell培养体系的抑制作用明显减低,这提示MSCs对NK细胞增殖的抑制作用可能需要MSCs与NK细胞的相互直接接触而实现。与IL-2培养体系单独培养的NK细胞相比,与MSCs共培养的NK细胞的杀伤活性受到了抑制,但是在对应的IL-2预先处理的MSCs共培养组,这种抑制作用明显减弱。实验显示,MSCs对NK细胞杀伤活性的抑制作用呈剂量相关。直接相互接触共培养与Transwell培养组的结果无明显差异,这在一定程度上提示MSCs对NK细胞杀伤活性的抑制可能是通过可溶性因子介导的。MSCs可以抑制NK细胞分泌IFN-γ、perforin （ p< 0. 05） ,且抑制作用呈剂量依赖性（ p< 0. 05） ,直接相互接触共培养与Transwell培养的结果无明显区别,但是,IL-2预先处理过的MSCs组NK细胞的IFN-γ、perforin分泌水平相对高于未处理组（ p< 0. 05）;由此可以看出,MSCs对免疫细胞的抑制作用是可调控的。利用K562细胞建立的NOD/SCID小鼠白血病模型中,可以看到,输注MSCs的小鼠在体重变化、生长迟缓、生存期及病理改变方面与对照组小鼠比较无差异;输注NK细胞组与未输注NK细胞的对照组相比,上述指标存在不同,差异具有统计学意义;NK细胞联合MSCs输注与单纯输注NK细胞组小鼠相比,上述指标无明显差异。全文结论:1.利用miniMACS免疫磁珠阳性分选可从人脐血中获得高纯度NK细胞;在细胞因子存在的合适培养体系中可进行有效扩增。联合应用IL-2+IL-15两种细胞因子的培养体系,可有效的扩增NK细胞,增强NK细胞的细胞毒活性及细胞因子分泌水平。2.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞增殖具有抑制作用,呈剂量依赖性,且细胞间的相互接触是参与这种抑制作用的主要机制之一。3.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞细胞毒活性具有抑制作用,呈剂量依赖性,且这种抑制作用主要通过可溶性因子介导。4.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞细胞因子分泌具有抑制作用,呈剂量依赖性,且这种抑制作用主要通过可溶性因子介导。5.急性白血病儿童骨髓MSCs对脐血NK细胞的免疫调节作用是可调控的,可受到IL-2或其它因素的影响而改变。6.采用NOD/SCID小鼠,环磷酰胺2mg/只腹腔注射预处理后尾静脉移植K562肿瘤细胞可成功建立白血病动物模型。7.急性白血病儿童骨髓MSCs与K562肿瘤细胞共移植至NOD/SCID小鼠,其在体内未发现有促进肿瘤细胞生长的现象。8.急性白血病儿童骨髓MSCs与脐血NK细胞联合输注至NOD/SCID荷K562白血病小鼠,MSCs在体内没有对脐血NK细胞的抗肿瘤效应有明显的抑制作用。