肺癌是世界上引起死亡最多的癌症之一。据最新的统计研究表明,肺癌是在男性中致死率最高的癌症,而在女性中,尤其是发展中国家的女性中,其致死率也非常高。另外根据相关权威统计,2008年我国肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤第1位,发病率达57个/10万,死亡率为46个/10万,并且肺癌死亡的病人约占国内癌症死亡总人数的22.7%。因此,研究肺癌的发病机制以及治疗手段非常急迫,对延长患者的生存率具有重要的意义。肺癌主要包括小细胞肺癌(small-cell lung carcinoma, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)。其中,SCLC约占肺癌总数的20%,NSCLC约占肺癌总数的80%。小细胞肺癌是一种以生长迅速、早期转移、高度侵袭性为特点的肺癌类型。非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)主要包括鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma)、腺癌(lung adenocarcinoma)和大细胞癌(pulmonary large cell carcinoma)三种。与小细胞癌相比,非小细胞肺癌细胞生长分裂较慢,转移扩散相对较晚,因此恶性程度较低。尽管如此,由于约75%的患者被发现患病时已处于中晚期,癌细胞已经发生转移,难以根治,因此5年生存率仍然很低。由于非小细胞肺癌占肺癌总数的大多数,因此,亟待开发有效的治疗非小细胞肺癌的方法。人类的NOB 1 (Nin1/RPN12-binding Protein1, NOB1)基因定位于染色体的16q22.1,包含9个外显子和8个内含子,其cDNA全长为1749bp,包含一个开放阅读框,有1271bp长,编码412个氨基酸序列的蛋白,分子量46kDa。NOB1蛋白具有两个非常保守的结构域,即位于NOB1蛋白N端的PIN(Pi1Taminoterminus, PIN)结构域和位于其C端的ZNRD1 (zinc ribbon domain containing 1,ZNRD1)结构域,两者共同构成了NOB1蛋白的主要部分。PIN结构域包括大约100个氨基酸,位于NOB1基因的N端。NOB1蛋白主要是通过PIN结构域来结合前体rRNA,从而进一步促使核酸内切酶在D位点裂开18SRNA的3’一末端,并使其成熟。23MRD1结构域位于NOB1蛋白的C端的第208到第296个氨基酸之间,其长约为90个氨基酸。目前的研究表明,NOB1是参与形成18S rRNA (ribosome RNA, rRNA) 的主要蛋白之一。更为重要的是,NOB1在26S蛋白酶体形成的过程中必不可少。而26S蛋白酶体是真核细胞内大分子的三磷酸腺苷(adenosine triphosphoric acid, ATP)依赖性蛋白溶解复合体,是泛素-蛋白酶体途径(ubiquity-proteasome pathway, UPP)的核心成分。UPP是细胞内重要的蛋白质降解机制,主要由泛素(ubiquitin, Ub)、泛素活化酶(u biquitin-activatingenzyme, E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes, E2)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-proteinligases,E3)、26S蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquitinatingenzymes, DUB)等组成。UPP可以高效高选择性的降解细胞内某些具有生物活性的蛋白质,特别是对降解细胞周期调节蛋白具有重要作用,从而起到调控细胞周期的作用。由于NOB1的这些功能,其可能对细胞周期有重要的影响,因此,研究NOB1基因在肿瘤中的作用,对开发有效的治疗肺癌的方法具有重要的参考价值。在本研究中,我们通过前期对非小细胞肺癌患者肿瘤组织样品的分析,发现NOB1基因在肿瘤组织中高表达。由于NOB1基因在细胞周期的调控中具有重要作用,因此,我们进一步在细胞水平研究NOB1对肺癌细胞的影响及相应的分子机制,为NOB1在非小细胞肺癌的基础研究和临床治疗研究提供一定的理论基础。本研究一共分为三个部分进行,第一部分主要是研究NOB1在非小细胞肺癌组织中的表达情况；第二部分主要是研究NOB1对肺癌细胞的增殖的影响：第三部分主要是探讨了NOB1影响肺癌细胞增殖的分子机制。一、NOB1在非小细胞肿瘤中的表达情况研究研究基因在肿瘤组织和相应的正常组织中的差异表达具有重要的意义。如果基因在正常组织中不表达,而在肿瘤组织中表达,那么这样的基因就具有较为重要的研究价值,因为针对这种特异在肿瘤组织中表达的基因开发出的相应的靶向药物的特异性就会较强,从而避免药物在杀伤肿瘤细胞的同时,正常的组织细胞也被杀伤。在我们的研究中,我们首先就通过免疫组织化学技术确定NOB1基因在非小细胞肺癌以及正常组织中的表达情况,观察NOB1基因是否在非小细胞肺癌组织中表达有差异。如果NOB1基因在非小细胞肺癌组织和正常组织中表达没有差异,那么我们进一步研究NOB1基因在非小细胞肺癌中的作用将没有太大的意义：如果NOB1基因基因在非小细胞肺癌组织和正常组织中表达具有差异,那么我们进一步研究NOB1基因在非小细胞肺癌中的作用具有重要的价值。我们的数据表明,NOB1基因确实是在非小细胞肺癌组织中高表达,并且阳性组织样品比例高达93.1%。尽管在我们收集的29个非小细胞肺癌组织样品中,还有6.9%的样品呈现NOB1阴性表达,但是在非小细胞肺癌患者中,NON1阳性具有如此高的表达比例足以表明研究NOB1基因在非小细胞肺癌中具有重要价值,暗示NOB1基因可能在非小细胞肺癌中发挥着重要作用。二、NOB1影响肺癌细胞的增殖我们采用免疫组织化学技术发现NOB1基因在非小细胞肺癌组织中呈现出较为特异的高表达,因此,我们在接下来的这一部分研究中,进一步研究了NOB1对肺癌细胞增殖的影响。我们首先根据NOB1基因的mRNA农达序列设计了能够特异干扰NOB1基因的序列,合成序列之后通过分子克隆技术构建到慢病毒载体之中,然后包装慢病毒并感染肺癌细胞系A549细胞以及H1299细胞。慢病毒介导的NOB 1基因的RNA干扰在肿瘤细胞中能够持续地表达降解NOB1基因mRNA 的 shRNA (short-hairpin RNA),并且慢病毒对A549细胞以及H1299细胞的感染效率极高,能够高效介导shRNA在肺癌肿瘤细胞中的表达,从而进步有效地沉默NOB1基因的表达。我们将慢病毒感染肿瘤细胞之后,利用qRT-PCR以及western-blot技术对沉默效率进行的鉴定,与我们的预期相符合,我们构建的shRNA慢病毒载体能够有效地沉默NOB1基因的表达,为后续进步研究NOB1基因在肺癌细胞中的作用奠定了基础。我们利用MTT实验来检测沉默NOB1基因之后,A549细胞以及H1299细胞这两种肺癌细胞系的增殖状况。MTT法是目前一种广泛用来快速简便测定细胞增殖的试剂。由于活细胞的线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够把MTT还原为甲瓒(Formazan),而甲瓒为蓝紫色的结晶物质,不溶于水,所以就沉淀在活细胞中,但是死细胞因为没有线粒体,故而不能还原MTT成为甲瓒。同时,二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)等有机溶剂能够把细胞中的甲瓒溶解出来,然后用酶标仪在特定的波长处测定溶液的吸光度值,就能间接反映出细胞的多少。在我们的实验研究中,利用MTT实验发现抑制NOB1基因的表达之后,A549细胞以及H1299细胞这两种肺癌细胞的增殖受到有效的抑制,并且随着细胞培养时间的延长,细胞的增殖抑制就越明显。肿瘤细胞分裂非常活跃,能够不停地增殖,具有从单个细胞分裂形成一个克隆细胞团的能力。细胞的克隆形成实验也是最常用来检测细胞增殖的一个重要方法。因此,在我们的研究中,还利用了细胞克隆形成实验来进一步验证NOB1基因沉默对肿瘤细胞的增殖抑制效应。我们首先检测了NOB1基因沉默之后,细胞克隆形态的大小,发现实验组即NOB1基因沉默组的肿瘤细胞克隆明显小于对照组。同时,我们进一步统计各组的细胞克隆数目也表明NOB1基因沉默组能够抑制肿瘤细胞克隆的形成,实验组的几乎没有细胞克隆,而对照组有大量的细胞克隆形成。进一步有力地证明了干扰NOB1基因之后,肿瘤细胞的增殖受到有效地抑制。这为进一步研究NOB1基因以及临床上针对NOB1基因做深入地开展治疗方法研究提供了基础研究价值和参考。我们的研究工作有力地证明了沉默NOB1基因之后能够有效地控制肿瘤细胞的增殖,并且在非小细胞肺癌组织中也发现NOB1基因具有较为特异的高表达,因此具有重要的临床应用价值。然而,我们只在两株肺癌细胞系A549和H1299细胞系中进行了实验。另外,体内的细胞微环境更加复杂,抑制NOB1基因能够是否能够控制肺癌的生长还需要在后续的实验中进一步进行动物体内实验。三、NOB1抑制肺癌肿瘤细胞增殖的机制研究由于NOB1基因沉默之后,细胞的增殖受到抑制,提示NO B1基因能够影响细胞周期。因此,我们对正常的A549细胞系、感染对照慢病毒的A549细胞以及感染NOB1-shRNA1慢病毒的A549细胞系的细胞周期进行研究。我们利用流式细胞术的方法来检测各组细胞的细胞周期。对流式数据进行进一步统计处理发现通过慢病毒介导的RNA干扰掉NOB1基因之后,A549肺癌细胞系的周期被阻滞在G0/G1期。实验组即感染NOB1-shRNA慢病毒的A549细胞这一组处于G0/G1期的细胞明显多于其他两组。感染NOB1-shRNA慢病毒的A549细胞组处于G0/G1期的细胞比例为69.32±0.45%,而正常A549细胞组为57.05±0.37%,感染对照慢病毒的A549细胞组这一比例为59.21±0.86%。同时,在感染NOB1-shRNA慢病毒的A549细胞这一组中,处于S期和G2/M期的细胞明显要少于正常A549细胞组和感染对照慢病毒的A549细胞组,进一步验证了NOB1基因被沉默之后,肿瘤细胞被阻滞在了G0/G1期我们收集正常的A549细胞系、感染对照慢病毒的A549细胞以及感染NOB1-shRNA慢病毒的A549细胞系这三组的细胞通过western-blot检测细胞周期相关基因CDK4、Cyclin D1、CDKN2A以及CDKN2B的表达。我们的数据表明,沉默NOB1基因之后,在感染NOB1-shRNA慢病毒的A549细胞中CDK4和Cyclin D1表达均下降,而CDKN2A以及CDKN2B的表达在这三组细胞中没有变化,表明NOB1通过下调细胞周期蛋白CDK4以及Cyclin D1来调控肺癌细胞的增殖。