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多巴胺(Dopamine,DA)是中枢神经系统内与神经精神疾病关系密切的一种神经递质,主要存在于黑质纹状体系;多巴胺转运体(Dopamine transporter,DAT)则是位于多巴胺能神经末梢突触前膜的一种膜蛋白,它特异性的再摄取DA入突触前末梢,而终止其对突触后神经元的作用,是反映多巴胺能神经体系功能状态的一个重要指标,已广泛用于神经配基显像技术,检测相关疾病脑内是否存在多巴胺能神经体系的障碍。诸多研究显示注意缺陷多动障碍(Attention-Deficit/ Hyperactivity Disorder, ADHD)大多在儿童和青少年时期发病,主要表现为注意力分散、活动过多等症状。男性患者明显多于女性,推测其发病可能与体内雄激素水平紊乱有关。神经显像技术检测发现,ADHD患者存在脑内DAT结合信号的改变,可能雄激素水平的紊乱改变了脑内DAT的表达。近年的研究表明,雄性甾类激素(anabolic– androgenic steroids, AAS)可以影响脑内的奖赏系统,对成年大鼠施予雄激素后,以β-CIT配基显像技术(PET或SPECT)检测到大鼠脑内存在β-CIT结合信号的变化。?-CIT是目前用于检测活体脑内DAT常用的配基,然而?-CIT除结合DAT外,还能结合脑内其它单胺能转运体如5-羟色胺转运体和去甲肾上腺素转运体。研究证实脑内大部分区域都有三种转运体的交织分布。因而,应用?-CIT配基显像技术难以判断DAT在脑内的真实改变。目的:本研究利用开放广场实验、免疫组织化学技术以及Western blot方法,观察丙酸睾丸酮早期处理大鼠行为和黑质-尾壳核DAT免疫反应强度的变化,探讨丙酸睾丸酮早期处理对大鼠行为和DAT表达的影响,藉以推测两者之间的相互关系,以期为ADHD发病的神经生物学机制提供部分实验依据。方法:选用健康雄性Wistar乳鼠,随机分为实验组和对照组,实验组(testosterone propionate,TP)乳鼠自生后7d至21d ,背部皮下注射丙酸睾丸酮( 500μg/d );对照组(vehicle,Veh)乳鼠相同部位注射等体积芝麻油。在生后46d和47d以开放广场实验观察大鼠运动行为变化,随后以免疫细胞化学、western blot技术检测实验大鼠脑内DAT在脑内的表达改变。结果:1.开放广场实验:在所观察指标中,丙酸睾丸酮处理组大鼠的水平运动及运动总径长在8min组和15min组的检测中其得分或长度较对照组有显著性差异(p<0.05);垂直运动得分在8min组第二天无意义(p>0.05),但存在增多的趋势,在15min组三天都具有统计学意义(p<0.05);清洁动作次数在8min组第一天无显著差别(p>0.05),但存在增多的趋势,在15min组三天都具有显著统计学差异(p<0.01)。此外,在成长期间,各组间体重无明显差别,但丙酸睾丸酮处理组大鼠在开放广场实验观察中行进路线较对照组复杂,对周围环境的警惕性相对增高。2.免疫组织化学的实验结果:①DAT(抗DAT单克隆抗体)免疫反应强标记信号主要分布在中脑黑质和尾壳核。早期丙酸睾丸酮处理大鼠可提高DAT在中脑黑质和尾壳核表达强度,通过静态灰度值分析发现:实验组黑质101.41±4.72,对照组黑质111.01±12.14;实验组尾壳核102.61±5.73,对照组尾壳核113.68±12.08,丙酸睾丸酮处理组大鼠的DAT灰度值明显低于对照组(P<0.01),在黑质和尾壳核分别降低了9.47%和10.79%。具有统计学意义。②TH免疫组化结果:与对照组相比,实验组黑质TH阳性神经元数目无明显差别(P>0.05)。黑质和纹状体TH免疫反应的静态灰度值分析结果显示实验组的灰度值明显低于对照组,分别降低了13.46%和14.15%(P<0.01),具有统计学意义。3. Western blot结果:Western blot结果显示与对照组相比,丙酸睾丸酮处理组各指标与β-actin条带相对吸光度比值明显升高。(1)DAT(抗DAT单克隆抗体)与β-actin条带相对吸光度值的比值在对照组大鼠分别黑质0.7044±0.0734(80kDa)和0.4179±0.041(50kDa),尾壳核4.2416±0.5436(80kDa)和1.0976±0.3659(50kDa);丙酸睾丸酮处理组大鼠为:黑质0.9081±0.0199(80kDa)和0.5374±0.0567(50kDa),尾壳核5.4952±0.6285(80kDa)和1.5117±0.1134(50kDa)。实验组大鼠80kDa和50kDa处DAT在黑质和尾壳核的相对吸光度比值较对照组升高(P<0.05),在黑质增高了28.9%(80kDa)和28.6%(50kDa),尾壳核增高了29.6%(80kDa)和37.7%(50kDa),具有统计学意义。(2)DAT(兔抗DAT多克隆抗体)与β-actin条带相对吸光度值的比值在对照组大鼠分别黑质1.0297±0.4702(80kDa)和0.4377±0.1389(50kDa),尾壳核0.5227±0.3035(80kDa)和0.2148±0.0898(50kDa);丙酸睾丸酮处理组大鼠为:黑质2.5606±0.8808 ( 80kDa )和0.7371±0.1302(50kDa),尾壳核1.1914±0.232(80kDa)和0.4352±0.0938(50kDa)。实验组大鼠80kDa和50kDa处DAT在黑质和尾壳核的相对吸光度比值较对照组明显升高(P<0.05),具有统计学意义。具有统计学意义。(3)TH与β-actin条带相对吸光度值的比值在对照组大鼠分别为:黑质1.4604±0.2174、尾壳核2.6931±0.2523;丙酸睾丸酮处理组大鼠为:黑质1.9263±0.1647、尾壳核4.2186±0.3987。实验组较对照组各个脑区TH与β-actin的比值增高(P<0.05),在黑质和尾壳核分别增高了31.9%和56.7%,具有统计学意义。结论:1.早期丙酸睾丸酮的处理改变大鼠青春期的运动行为,主要表现为水平运动、垂直运动、总径长和清洁动作次数的增多;2.早期丙酸睾丸酮的处理增加大鼠黑质-尾壳核DAT的含量;3.早期丙酸睾丸酮的处理增加大鼠黑质-尾壳核TH的含量。4.早期雄激素水平的紊乱可能通过改变脑内DA能神经体系而影响大鼠的运动行为,这很可能与ADHD发病的神经生物学机制有关。