E2-EPF是E2泛素结合酶家族成员之一,分子量为24KD,在多种肿瘤组织中高表达。E2泛素结合酶同E1泛素激活酶,以及E3水解酶一起,催化蛋白质泛素化,进而被蛋白酶小体降解。肿瘤抑制因子pVHL是E3泛素水解酶复合体的一部分,它可使HIF等降解。E2-EPF泛素结合酶可使pVHL发生水解,进而使得HIF-1(?)表达水平增强。HIF-1(?)作为细胞低氧应答反应中起核心作用的转录因子,能调节100多种与低氧应激下细胞适应和存活相关的靶基因。HIF-1(?)是参与肿瘤增殖、血管增生、转移等过程的重要分子。E2-EPF泛素结合酶表达水平增高,可通过pVHL-HIF-1(?)途径促进癌细胞增殖、侵袭和转移。E2-EPF在宫颈癌细胞中的作用尚未见报道,本研究旨在阐明E2-EPF在宫颈癌细胞中的表达水平和功能。主要研究内容如下：一、E2-EPF在宫颈鳞状细胞癌组织中高表达选取了宫颈鳞状细胞癌标本75例,正常宫颈组织13例为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术检测E2-EPF mRNA表达水平,结果发现宫颈癌组织中E2-EPF mRNA水平是正常宫颈组织的4.08倍；Ⅱ期以上宫颈癌组织中E2-EPF的mRNA表达水平是Ⅰ期的2.72倍,二者均具有显著差异。由此可见,E2-EPF在宫颈癌组织中也呈高表达状态,并且与肿瘤细胞的恶性程度有一定的相关。二、宫颈癌细胞系SIHA E2-EPF低表达克隆的建立采用商品化E2-EPF shRNA质粒载体下调细胞内源性E2-EPF。通过脂质体将E2-EPFshRNA质粒载体转染入SIHA细胞,并通过嘌呤霉素筛选获得了稳定的E2-EPF低表达克隆,共筛选获得15个E2-EPF低表达克隆,mRNA水平下降可达到正常SIHA细胞的18%左右,蛋白水平降至正常水平的20%左右。三、E2-EPF下降后导致HIF-1(?)的表达下降由于HIF-1α在常氧状态下极不稳定,常规的方法不易检测到HIF-1α的存在。本实验采用荧光素酶报告系统成功的检测到微量的HIF-1α。结果显示,E2-EPF的表达与HIF-1a成正相关,低表达克隆细胞内HIF-1a水平较正常对照组明显降低。四、E2-EPF下调后对细胞周期、增殖及侵袭性生物学特性的影响采用MTT细胞增殖实验检测发现,E2-EPF低表达克隆細胞的增殖速度显著低于正常和对照细胞。软琼脂克隆形成实验发现,E2-EPF低表达克隆细胞其克隆形成能力远远低于正常和对照细胞。以流式细胞术检测细胞周期发现,E2-EPF低表达克隆细胞的GO-G1期细胞百分比显著增加,S和G2-M期(尤其是S期)细胞数减少,细胞增殖减慢。采用经典的Transwell小室研究E2-EPF对细胞侵袭能力的影响发现,E2-EPF低表达克隆细胞穿膜细胞较正常和对照细胞明显减少。本部分研究结果说明,E2-EPF下调后对SIHA细胞的细胞周期、增殖及侵袭性等生物学行为具有显著的影响。五、E2-EPF下调对放、化疗的影响细胞经0Gy,4 Gy,7 Gy,10 Gy4个不同剂量X线照射后,采用MTT法检测细胞相对数量,发现不同剂量下,E2-EPF低表达克隆细胞的存活数量和正常、对照组细胞没有显著差异。采用Annexin-V.PI联合的流式细胞术检测细胞凋亡发现,各个剂量下,细胞凋亡和死亡的数量在各组之间没有差异。说明E2-EPF下调后,对细胞的放疗耐受性没有显著影响。采用不同机理化疗药物：顺铂、紫杉醇、多烯紫杉醇、拓扑替康、依托泊苷、表阿霉素,以不同浓度分别加入各组细胞中,观察E2-EPF下调后是否对化疗药物疗效有一定影响。采用MTT法检测细胞存活的相对数量,结果发现：降调内源性E2-EPF水平,可以增加细胞对拓扑异构酶Ⅰ抑制剂——拓扑替康,拓扑异构酶Ⅱ抑制剂——依托泊苷和表阿霉素的敏感性,但是对顺铂、紫杉醇和多烯紫杉醇的作用无明显影响。以上试验说明,E2-EPF下降后增加了部分化疗药物的疗效,可以作为宫颈癌化疗联合用药的一种增效途径。六、E2-EPF下调后裸鼠成瘤能力显著下降本实验通过接种一定数量的肿瘤细胞,发现E2-EPF低表达组肿瘤生长速度减慢、瘤体大小减小。E2-EPF低表达组平均瘤体重量仅相当于对照组的1/4,这就提示E2-EPF在肿瘤的发展中具有重要的作用。体内实验进一步说明降调E2-EPF的表达可以作为晚期宫颈癌生物学治疗的重要方法。结论：E2-EPF在宫颈癌组织中成高表达状态,且其表达量的高低和临床肿瘤分级具有一定的相关性。通过RNAi下调E2-EPF的表达之后,HIF-1(?)的表达随之下调；细胞的增殖能力下降、细胞周期中Go-G1期细胞数显著增加；细胞克隆形成能力下降、侵袭力下降；裸鼠成瘤性下降；并能增强化疗药物拓扑异构酶抑制剂的疗效。E2-EPF是参与宫颈癌发生和发展的重要分子,针对E2-EPF的治疗手段可望成为宫颈癌治疗的新途径。