第一部分 基于TMT标记的蛋白质组分析发现候选蛋白背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的早期筛查对于改善其预后至关重要。由于液体活检较低的创伤性且结果具有较高的重复性,目前在临床和科研中越来越多地考虑使用此类方法来诊断癌症等不易发现的疾病。而表达肿瘤特异性蛋白的循环外泌体（本文主要研究从血浆中分离出的外泌体）是各种癌症极有潜力的生物标志物。方法:从10名健康个体（N组）,10名无转移的CRC患者（Ca组）和10名有肝转移的CRC患者（M组）组成的队列1中收集血浆样本。使用超速离心结合蔗糖密度梯度离心的方法,从队列1分离血浆外泌体并使用透射电子显微镜、蛋白免疫印迹和粒径分析仪鉴定外泌体特征。使用与其他质谱方法相比具有更高精确度和灵敏度的基于串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）的鸟枪法（shotgun）进行全蛋白质组分析和磷酸化蛋白质组分析,结合生物学特征,挑选出肿瘤特异性血浆外泌体蛋白。结果:从队列1的3个分组中均提取到的细胞外囊泡符合外泌体的形态结构、粒径范围和分子特征。从血浆外泌体中总共鉴定出545种蛋白（Swiss Prot数据库）,并测定出462种蛋白的表达水平。鉴定了195个蛋白的252个特异的磷酸肽和347个磷酸化位点,其中177个蛋白的315个位点能够被定量。基因本体论（Gene ontology,GO）的功能分类分析显示,许多外泌体蛋白参与细胞间的通讯,代谢过程,刺激反应和生物发生。聚类分析显示队列中三组人群蛋白表达存在显著差异,其中纤维蛋白原α链（fibrinogenαchain,FGA）,纤连蛋白（fibronectin 1,FN1）,S100A9和触珠蛋白（haptoglobin,HP）及其磷酸化水平在不同组人群有显著差异表达水平。结论:结直肠癌患者和健康对照组的血浆外泌体蛋白质组和磷酸化蛋白质组存在显著差异。血浆外泌体中HP,S100A9,FGA和FN1的蛋白表达量及磷酸化水平与CRC进展密切相关。第二部分体内外分子实验验证与候选蛋白FGA的挑选目的:在独立验证队列中对前述选定的结直肠癌血浆外泌体差异蛋白进行分子学实验验证,并从中挑选差异最明显,最有潜力的血浆外泌体候选蛋白标志物。初步探索血浆外泌体候选蛋白标志物出现差异的原因。方法:建立由11名健康人（N组）,11名无肝转移的CRC患者（Ca组）和6名有肝转移的CRC患者（M组）组成的队列2;由19名健康人（N组）,19名无肝转移的CRC患者（Ca组）,20名结直肠腺瘤患者（A组）和3名有肝转移的CRC患者（M组）组成的扩大队列3;分别使用人CRC细胞系进行体外实验,由注射SW620（n=5）或Lo Vo（n=4）建立的裸鼠皮下瘤模型进行体内实验。使用超速离心结合蔗糖密度梯度离心的方法,从队列2、3和裸鼠模型中分离血浆外泌体,从细胞系培养上清中分离外泌体。然后使用蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）在独立队列2中对挑选的蛋白HP,S100A9,FGA和FN1进行验证,并挑选出了一个在该方法中差异最明显的候选标志物FGA。在队列3中使用WB进一步验证了候选生物标志物FGA。检测FGA在不同细胞系和裸鼠荷瘤前后的血浆外泌体中的表达差异。结果:在不同的队列中,所有候选蛋白质均显示出显著差异,其中FGA是区分最明显的生物标志物。但FGA高表达的血浆外泌体在本研究手段中无法用于预测结直肠癌肝转移,仅表现出提示结直肠腺瘤高风险的潜力。和NIH 3T3细胞系来源的外泌体相比较,SW620和Lo Vo细胞系来源的外泌体明显含有更高表达水平的FGA。在皮下注射SW620（n=5）或Lo Vo（n=4）细胞建立的裸鼠皮下瘤模型显示,血浆外泌体中FGA的表达水平随着皮下瘤的形成而显著增加。结论:血浆外泌体的FN1,HP,S100A9和FGA的表达水平在CRC患者和健康对照间均显示出分子实验水平上的差异,其中FGA是区分最明显的生物标志物。对人CRC细胞系和裸鼠皮下瘤模型的分析表明,血浆中高表达FGA的外泌体可能来自亲本CRC肿瘤细胞。因此,我们在四个外泌体差异蛋白中,选择FGA作为候选的液体活检生物标志,并据此展开后续实验。第三部分优化DIA-MS以用于结直肠癌临床早期筛选目的:为液体活检提出一种基于数据独立采集质谱（data-independent acquisition-mass spectrometry,DIA-MS）的诊断方法并予以验证,以在早期阶段（如腺瘤）快速,无创地筛选出结直肠癌。同时,验证提取血浆外泌体这一步骤的必要性。方法:建立有12名健康个体（N组）,13例腺瘤患者（A组）和12例无肝转移的CRC患者（Ca组）的队列4。在其中20个未进行外泌体提取的血浆样品（n=6、7、7）上进行初始DIA-MS分析,比较在未提取血浆外泌体的情况下是否能用FGA的表达水平区分3组人群。使用超速离心结合蔗糖密度梯度离心的方法,从队列4中提取血浆外泌体。使用20分钟,45分钟,60分钟和90分钟的四个不同LC梯度分析了6号样品的蛋白质组,比较不同LC梯度下鉴定到肽段和蛋白质的重复度,在10个样品中（分别来自健康个体和腺瘤患者中的三名,无肝转移的CRC患者中的四名）测试将LC梯度从90分钟降低到20分钟的蛋白质组数据减少的程度,在保证鉴定蛋白和肽段数量的情况下选择出最短的LC梯度。DIA-MS结果中候选标志物的结果使用平行反应监测靶向测定（parallel reaction monitoring,PRM-MS）定量进行再一次验证。结果:通过将LC梯度从90分钟降低到20分钟,我们仍然可以检测到87%的蛋白质（353/406）。此外,使用20分钟LC梯度检测缺失的少量蛋白质不会影响数据的临床应用。不进行提取外泌体的操作,直接使用血浆样本进行DIA-MS分析,三组之间的FGA水平没有显著差异,这表明不能直接在血浆中检测到FGA表达的差异（p＞0.05）。此外,经过梯度优化的DIA-MS分析表明FGA高表达的血浆外泌体可以将健康人从CRC患者和结肠腺瘤患者中区分出来。在接受者操作特征曲线（ROC）中的曲线面积（AUC）分别为0.949和1.000,优于本研究选用作对比的常规肿瘤生物标志物癌胚抗原CEA及CA19-9（AUC分别为0.809,0.548和0.531,0.647）。通过PRM-MS检测的三个组别中血浆外泌体FGA的相对表达结果与DIA-MS的结果一致。结论:使用梯度优化的DIA-MS鉴定的FGA阳性血浆外泌体可以凭比两种常用肿瘤生物标志物更高的特异性和敏感性来识别出结直肠腺瘤和CRC患者,很有潜力作为鉴定早期CRC的一种无创筛查生物标志物。并且,进行血浆外泌体的提取是一项必要操作。