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树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）能够将木糖有效的转化成乙醇，是最具工业生产前景的戊糖酵母之一。自然界中有丰富的植物纤维资源，充分合理利用这些农林废弃物，通过生物转化生产对人类有用的产品，具有十分重要的的现实和长远意义。野生型菌株对木糖的转化率及菌体生长量还未达到工业菌株的要求，而在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）搭建的木糖代谢途径并未实现木糖有效地转化成乙醇。因此，通过对S. stipitis进行基因工程操作来提高木糖转化率，以及构建一株新型的酵母基因工程菌，已经成为研究热点。但S. stipitis具有编码偏好性，密码子CUG识别Ser，而不是常见的Leu，导致富含CTG的外源基因在S. stipitis中不能表达或表达效果不佳，限制分子生物学技术的应用。本论文构建适用于S. stipitis的筛选标记并通过定点突变修饰Cre/Loxp重组系统，实现乙醛脱氢酶Ⅴ基因（Aldehyde dehydrogenase5，ALD5）无痕敲除，为S. stipitis的遗传转化研究提供基础工具，并以此为基础为开发外源基因表达体系奠定基础。本论文对S. stipitis染色体倍性进行验证。使用DNA含量参比法对S. stipitis染色体倍性进行了分析，根据S. cerevisiae单倍体与二倍体染色体含量的特征性差异，测定DNA含量并分析，确定S. stipitis为单倍体细胞。构建尿嘧啶营养缺陷型和抗药性筛选标记为分子生物学操作作准备。通过重叠PCR法构建S. stipitis URA3基因同源重组片段。双交换同源重组敲除URA3基因，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株S. stipitis （ura3-）。酵母中常用抗性筛选标记有G418和HygromycinB，实验结果表明该菌株对G418具有较强抗性，对Hygromycin B较敏感，选择Hygromycin B作为新的抗药性筛选标记。Cre/Loxp系统中含有Cre重组酶基因和Hygromycin B抗性基因两个外源基因，将CDS区中CTG密码子定点突变成TTG，在S. stipitis中编码有活性的蛋白。以ALD5为靶基因，构建ALD5基因同源臂片段，同时中间插入含Loxp位点的URA3基因作为选择标记，敲除其ALD5基因，获得重组菌S. stipitis（ald5-）。半乳糖诱导Cre重组酶表达并切除URA3基因，获得菌株S. stipitis（ald5-ura3-），重组率达到50%，GAL启动子可以在S. stipitis中启动外源基因的转录。