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目的腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是以腹主动脉中层弹力纤维降解损伤导致的扩张为特点。西方流行病学调查显示,近年来AAA的发病率不断迅速上升,男性约为1.3-8.9%,女性为1.0-2.2%。AAA破裂将直接危急患者生命。在美国每年大约有45000人死于AAA的破裂。AAA已被证明是一种复杂和动态的血管重塑再造过程,而不是单纯的动脉硬化退行性病变。最近的有关人AAA组织及动物模型研究显示免疫反应在动脉瘤疾病的发病机制中起着重要的作用。其中,自身免疫在AAA的发生和发展中所起的作用正逐渐被认识。我们最近的研究显示,AAA患者体内的T淋巴细胞存在着Fas功能缺陷,对由Fas诱导的细胞调亡不敏感,表现为不断增殖的特性,研究提示过多的致病性的自身反应性T淋巴细胞在AAA患者外周血中长期存活并增殖,识别腹主动脉组织的自身抗原,引发了一系列与腹主动脉扩张直接相关的自身免疫反应、生物化学反应及生物机械力学反应。在机体免疫应答中,T淋巴细胞能够识别入侵人体的外源性物质(如病原微生物等),引发一系列免疫反应,使人体免受外源性物质的侵犯。最近的研究发现这些T细胞又受到第二组细胞—调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的调控。Treg细胞能够保证T淋巴细胞不会攻击人体自身正常细胞及组织,从而避免自身免疫损伤。因此Treg细胞在维持外周免疫自身耐受及稳定中起到了关键作用。影响Treg细胞发育及活性发挥的因素很多,新近发现的叉头/翼状螺旋转录因子(forkhead box P3,Foxp3。小鼠为Foxp3,人类为FOXP3),因其直接主控Treg细胞表型及活性,在机体自身免疫的稳定中起到了决定性作用,成为研究Treg细胞调控的焦点。研究证实,无论是在动物还是人类,CD4~+CD25~+Treg细胞数量的减少和/或功能的障碍都会引起自身免疫疾病,同时,Foxp3突变、缺失及表达下降也可以引起自身免疫性疾病。因此,本研究的目的是通过分析AAA患者和健康人群外周血中Treg细胞数量、FOXP3 mRNA和蛋白表达及CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞的抑制功能来证实导致AAA自身免疫损伤源于机体免疫系统上游的调节障碍,从而揭示AAA发生发展的分子生物学基础。实验方法1、采用流式细胞仪对AAA患者外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞的数量进行分析及与正常人群的对照研究。2、采用流式细胞仪对AAA患者外周血中CD4~+CD25~+FOXP3~+调节性T淋巴细胞的数量进行分析及与正常人群的对照研究。采用Western蛋白质印迹及Real time PCR技术进行FOXP3蛋白、FOXP3mRNA在AAA患者外周血单个核细胞表达的分析。3、通过对AAA患者外周血中CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞抑制CD4~+CD25~-T淋巴细胞功能与正常人群外周血中CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞抑制CD4~+CD25~-T淋巴细胞功能对比的分析,探讨CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞在AAA患者外周血中的功能障碍,同时探讨它们的抑制功能与FOXP3表达相关性。实验结果本试验应用流式细胞仪(FACScalibur,FACSAria,BD Biosciences)分析22名AAA患者和32名健康对照者外周血CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞数量,进行比较。结果发现,AAA患者的CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+T细胞的百分比(均值±标准差5.69±0.99%)较健康对照组(均值±标准差5.88±1.55%;P＞0.01)减少,但差异无统计学意义。采用流式细胞仪对人外周血CD4~+CD25~+Treg细胞进行分离纯化,并对CD4~+CD25~+T细胞纯度进行鉴定,纯度大于95%。而AAA患者的CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞占CD4~+T细胞(均值±标准差2.45±0.57%)比值明显低于健康对照组(均值±标准差3.69±0.82%;P＜0.01),差异具有统计学意义。本试验采用Western蛋白质印迹及Real time PCR技术进行FOXP3蛋白、FOXP3mRNA在AAA患者和健康对照组外周血单个核细胞表达的分析。AAA患者的FOXP3蛋白及FOXP3mRNA表达明显低于健康对照组(P＜0.01),差异有统计学意义。分选后的CD4~+CD25~+及CD4~+CD25~-T细胞在不同的比例下进行培养,MTT法测定A值并进行抑制率的计算,发现无论是AAA患者还是健康人群,当CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~-T细胞的比例为1:1时有最大的抑制率。与新鲜分离的健康对照者的CD4~+CD25~+Treg细胞的增殖能力相比,新鲜分离的AAA患者的CD4~+CD25~+Treg细胞的增殖能力也很低。新鲜分离的AAA患者的CD4~+CD25~+Treg细胞对CD4~+CD25~-T淋巴细胞的抑制能力明显低于新鲜分离的健康对照者的CD4~+CD25~+Treg细胞对CD4~+CD25~-T淋巴细胞的抑制能力(P＜0.01;n=10)。其次,为了明确AAA患者Treg细胞对效应细胞CD4~+CD25~-T淋巴细胞增殖抑制能力的下降是否与其内在的功能降低或效应细胞对Treg细胞的抑制能力的对抗增加有关,我们对AAA患者及健康人群新鲜分离的CD4~+CD25~+Treg细胞和CD4~+CD25~-T淋巴细胞进行了交叉混合培养,发现从AAA患者新鲜分离的Treg细胞除了对其自身的效应细胞的增殖抑制力下降,对新鲜分离的健康人群的效应细胞的增殖抑制力也下降。而从健康人群新鲜分离的CD4~+CD25~+Treg细胞不但能很好的抑制其自身效应细胞的增殖,且也能明显抑制新鲜分离的AAA患者的效应细胞CD4~+CD25~-T淋巴细胞的增殖。通过线性回归分析,AAA患者和健康人群外周血中的单个核和细胞(PBMC)的FOXP3蛋白及FOXP3mRNA的表达与CD4~+CD25~+T细胞的抑制功能存在正向关。结论本实验研究表明,在本组AAA患者与健康人群相比,虽然不存在着CD4~+CD25~+Treg细胞数量的下降,但CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞数量存在着下降,以及FOXP3蛋白、FOXP3mRNA在外周血单个核细胞的表达下降。同时本组AAA患者中,CD4~+CD25~+Treg细胞的抑制功能存在着障碍,AAA患者外周血CD4~+CD25~+Treg细胞的调节功能的缺陷主要是由于CD4~+CD25~+Treg细胞的功能缺陷,而不是患者效应细胞对Treg细胞的抑制能力的对抗增加所致。并且这种功能障碍与FOXP3蛋白、FOXP3mRNA在外周血单个核细胞的表达呈正向关。