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磷脂酶D（PLD,EC 3.1.4.4）是一类属于PLD超家族的酶,其不仅能够催化水解磷脂的磷酸二酯键,还能够催化某些含有羟基的化合物结合到磷脂的酰基链上,形成新的磷脂。与其他微生物来源PLD相比,链霉菌PLD因其具有较高的催化活性和广泛地底物识别范围而被用于合成天然或新型的功能性磷脂。链霉菌PLD之间具有显著的序列相似性,但由于其结构-功能关系信息的极度缺乏严重阻碍了对链霉菌PLD底物识别机制的认识,进而限制了其蛋白质工程和工业化应用。通过系统探究链霉菌PLD结构与功能关系,评估链霉菌PLD的底物识别机制,可为挖掘具有特殊磷脂识别特性的PLD带来新的见解,进而为PLD未来分子改造和工业化应用提供指导。本课题以海洋克伦基链霉菌磷脂酶D（Streptomyces klenkii,SkPLD）为研究对象对其进行了酶学性质表征,在此基础上采用分子对接方法揭示其酰基链特异性的分子基础。设计和突变SkPLD活性位点loop结构（残基376-382）中的Ser380残基为疏水性氨基酸,阐明SkPLD活性位点loop疏水性对酶界面吸附和底物识别的影响及机制。进一步分析SkPLD底物结合口袋的疏水性和空间体积与其转磷脂酰化活性和磷脂酰丝氨酸合成能力的关系。主要研究内容及结果如下:（1）SkPLD的生物信息学分析与异源表达。从NCBI数据库中获得SkPLD氨基酸序列,将其归类为PLD超家族。构建了p ET-28a-SkPLD大肠杆菌表达菌株,在16°C、200 rpm、1 m M IPTG诱导表达12 h后,在大肠杆菌SHuffle T7胞内获得了可溶性的重组SkPLD酶蛋白。采用Ni离子螯合层析、阴离子交换层析和分子筛纯化获得了高纯度的SkPLD酶蛋白。以大豆磷脂酰胆碱（PC）为底物测定的SkPLD的比活性为26.93 U/mg。（2）SkPLD的酶学性质表征。SkPLD的最适反应温度为60°C,最适反应p H为8.0。以大豆PC为底物,SkPLD的Vmax为41.65±1.84 U/mg,KM为1.33±0.13 m M。链长选择性结果表明SkPLD偏好于中短链PC底物。分子对接结果证实SkPLD对C12-PC具有最高的结合能-7.54 kcal/mol,这是由于SkPLD与C12-PC复合物具有相对最多的8个氢键。乙醚作为有机相,在40°C条件下振荡反应12 h,SkPLD催化获得的磷脂酰丝氨酸（PS）的得率为26.18%,PS积累浓度为1.31 mg/m L。（3）SkPLD活性位点loop疏水性对酶界面吸附的调控。通过定点突变的方法,获得SkPLD活性位点loop的突变体,并在野生型（WT）和突变体基础上设计了H167A突变体。除突变体S380G外,所有被测突变体的催化效率均有较大提高。突变体S380V(136.15 s-1 m M-1)和S380A(99.00 s-1 m M-1)的催化效率分别为WT的4.8倍和3.5倍。相较于WT/H167A,S380V/H167A突变体吸附到大豆PC单分子层吸附平衡常数(KAds)值的增加表明酶对PC单分子层的吸附稳定性更高。SkPLD对短链和中链PC单分子层的最大插入压力（MIP）值更大,说明SkPLD对短链和中链PC的单分子层渗透能力更强。与WT/H167A相比,S380V/H167A突变体对C6、C8、C12、C14和C16-PC的协同因子值均增加。与WT相比,S380V突变体对C6-C16 PC的比活性显著增加（P＜0.01）,这可能与S380V/H167A对C6-C16的PC单分子层的协同因子增加有关。（4）SkPLD活性位点loop突变体对酶底物特异性的影响。与WT/H167A相比,S380V/H167A突变体对PC、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰肌醇（PI）单分子层的MIP值显著升高（P＜0.01）。协同因子表明S380V/H167A突变体和PC、PE、PG和PI单分子层之间存在良好的结合特性。此外,S380V/H167A突变体对PS单分子层的解吸常数（kd）值降低导致了KAds值的增加,说明了S380V/H167A突变体对PS单分子层的吸附稳定性较高。吸附动力参数和结合特性结果提示S380V突变体可能具有更高的PS合成活性。与WT（110%）相比,S380V突变体的PS/PA比率显著提高（144%）。与WT相比,S380V突变体表现出更多的氢键和范德华力相互作用,这可能导致酶-底物复合结构的稳定性提高。WT与PC复合物的结合能为-5.61 kcal/mol,而由于分子间的氢键、范德华力以及疏水相互作用,S380V突变体与PC复合物因此具有更强的结合能（-6.32 kcal/mol）。（5）底物结合口袋疏水性和空间体积对SkPLD催化合成磷脂酰丝氨酸的影响。与WT的催化效率(28.04 s-1 m M-1)相比,突变体P343A、Y383L和P343A/Y383L的催化效率分别为WT的1.39倍、2.15倍和7.14倍。P343A/Y383L突变体的底物结合口袋的体积大小为713.34?,高于WT（690.05?）。WT中His167（N）-PC（P）与Lys169（N）-PC（P）之间的原子间距离分别为3.7?和4.2?,而P343A/Y383L突变体中His167（N）-PC（P）与Lys169（N）-PC（P）之间的原子间距离则分别减少至3.5?和3.5?。此外,WT与配体之间的结合能为-5.19 kcal/mol,而P343A/Y383L突变体与配体之间的结合能更高,为-5.95kcal/mol。这些结果表明,相较于WT,PC分子能够更轻易的进入P343A/Y383L突变体的底物结合口袋并形成一个更加稳定的酶与底物的中间体。P343A/Y383L突变体介导的转磷脂酰化反应中的最大PS得率和选择性分别为91.28%和93.86%,本研究中P343A/Y383L突变体催化的转磷脂酰化反应相较于其他链霉菌PLD具有明显优势。因此,基于调整底物结合口袋的空间体积及疏水性的组合策略会增加SkPLD底物结合口袋的可用空间和对底物的亲和性,这一组合策略可能为设计具有理想转磷脂酰化活性的PLD带来新的见解。