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研究背景: 梅毒(Syphilis)是由苍白密螺旋体(Treponema pallidum)感染所引起的性传播疾病(STD,Sexually transmitted diseases)。该病对人体具有多重的危害,其病原体能够侵犯皮肤黏膜、淋巴结、心血管系统和神经系统,从而造成组织损伤和多器官功能障碍,还可以通过母婴垂直传播,导致先天性梅毒的发生,造成早产、流产或死胎,严重影响出生人口的质量,同时,梅毒疾病在HIV的感染和致病等过程中也具有一定的促进作用。在建国初期,梅毒疫情曾一度被消灭,自上世纪80年代后,随着人们生活方式的改变以及人口流动的增加,梅毒疫情在我国呈现复发趋势,其年发病数约40万,居乙类传染病第三位,仅次于病毒性肝炎和肺结核。为了控制梅毒疫情的扩散,临床的早期诊断和规范治疗具有重要意义。 目前,梅毒病原体尚无理想的体外培养方法,临床上用于梅毒诊断的方法主要包括暗视野显微镜检查和血清学试验。前者受制于疾病病期、标本类型和检测仪器等因素的影响,对于没有明显症状或体征的患者缺乏适用性,临床应用并不广泛;后者则是梅毒实验室诊断的主要方法,是临床确诊的重要参考依据。近年来,梅毒血清学试验发展迅速,利用基因工程重组抗原所建立的检测方法呈现出良好的发展前景,其中,以酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化学发光法(Chemiluminescence test,CMIA)最具代表性,这类方法虽能够实现自动化检测,具有较高的敏感性和特异性,但仍然存在一定局限性,对于梅毒感染早期的患者,可能出现假阴性结果;与经典的TPPA法检测结果存在矛盾的情况,因此,优化和完善梅毒的血清学试验对于提高该病的诊断效率具有重要意义。TP17、TP47蛋白是梅毒螺旋体的特异性脂蛋白,具有较强的免疫原性和免疫反应性,是梅毒诊断试剂中最为重要的两种抗原,这两种蛋白的鉴定和评估,是优化和完善现有的梅毒血清学试验的重要途径。 目的: 1.通过原核基因工程技术克隆表达梅毒螺旋体TP17、TP47蛋白,建立重组蛋白克隆表达和纯化的工艺,为评估这两种蛋白在梅毒血清学诊断中的应用价值提供物质前提,也为未来鉴定新的重组蛋白奠定基础; 2.建立基于TP17、TP47蛋白的间接ELISA检测方法,初步探讨这两种蛋白在梅毒血清学诊断中的应用价值,为进一步优化和完善现有的血清学诊断方法,开发具有自主知识产权的新一代梅毒诊断试剂提供重要的实验依据。 方法: 1.应用PCR扩增梅毒螺旋体TP17、TP47基因,构建原核表达载体pET-28b-TP17和pET-28b-TP47,通过酶切分析和测序来鉴定重组质粒;将重组质粒转化到E.coli BL21中,以IPTG诱导表达,使用镍离子亲和层析柱来纯化重组蛋白; 2.利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术,以获得重组蛋白的肽指纹图谱(Peptide mass fingerprinting,PMF),将图谱数据在NCBInr、Swiss-Prot数据库中进行检索比对,以鉴定重组蛋白; 3.将重组蛋白进行SDS-PAGE分析,电泳后的凝胶电转移至PVDF膜,以临床收集的TPPA结果阳性的混合血清作为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗,进行免疫印迹分析; 4.以重组蛋白TP17、TP47作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,通过实验确定最佳的抗原包被条件和封闭方式、最佳的包被抗原浓度、酶标二抗稀释度、最适的血清反应时间以及显色时间等条件; 5.以建立的间接ELISA法来检测临床收集的126份血清标本,评估方法的检测性能,并探讨TP17、TP47蛋白在梅毒血清学诊断中的应用价值。 结果: 1.PCR扩增获得梅毒螺旋体TP17、TP47基因,构建的原核表达载体pET-28b-TP17和pET-28b-TP47测序结果表明,克隆基因的核酸序列与GenBank数据库中登录的序列完全一致; 2.重组工程菌在IPTG的诱导下进行表达,分别获得分子量约为20kDa和42kDa的包涵体蛋白,利用亲和层析技术成功获得纯度较高的重组蛋白; 3.MALDI-TOF-MS和免疫印迹鉴定表明,诱导表达的重组蛋白正是梅毒螺旋体TP17和TP47蛋白,两种蛋白均能够与TPPA结果阳性的混合血清发生特异性反应,与TPPA结果阴性的血清不发生反应; 4.建立了基于TP17、TP47的间接ELISA检测方法,其最佳抗原包被条件为直接4℃过夜,最佳封闭方式为1％BSA在37℃孵育4h,然后4℃过夜,最佳抗原包被浓度分别为2μg/ml(TP17)和4μg/ml(TP47),最佳的二抗稀释度为1:20000,最佳的血清反应时间分别为30min(TP17)和45min(TP47),最佳的显色时间分别为15min(TP17)和20min(TP47); 5.基于TP17的ELISA间接法的检测敏感性和特异性分别为100%和98.1%,与TPPA和CMIA的检测符合率均为99.2%(125/126);基于TP47的ELISA间接法的检测敏感性和特异性分别为95.8%和96.3%,与TPPA和CMIA的检测符合率均为96.0%(121/126)。 结论: 1.基于pET-28b载体和E.coli BL21宿主菌的原核表达系统能够使TP17、TP47基因获得高效表达; 2.重组蛋白TP17、TP47均具有较为敏感和特异的免疫反应活性; 3.TP17、TP47蛋白在间接ELISA的方法学建立中均具有良好的应用价值,通过进一步优化和完善以上检测方法,将为开发具有自主知识产权的新一代梅毒诊断试剂提供重要的实验依据。