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异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前治愈白血病、淋巴瘤等恶性血液肿 瘤的重要手段,近年来取得了重要进展,患者的长期生存率明显提高。但移植物抗宿 主病(GVHD)仍然是allo-HSCT的主要并发症,是移植相关死亡及影响患者生存质 量的重要原因。GVHD的主要效应细胞是移植物中的 T 淋巴细胞。GVHD的防治措 施有多种,但临床上仍有30%~70%的allo-HSCT患者移植后发生aGVHD。我们在过 去的研究中建立了C57BL/6小鼠与Balb/c小鼠的移植模型,为研究GVHD提供了一 个有用的技术平台,但人的外周血造血干细胞(PBSC)移植物及T淋巴细胞在GVHD 中的作用及其对防治干预的反应仍需建立以人的细胞为基础的移植模型。本研究以 NOD-SCID 小鼠为基础建立了 NOD-SCID-Hu 人小鼠嵌合 GVHD 模型,研究人 T 细 胞在NOD-SCID小鼠体内分布与GVHD的关系,以及YCD/5-FC自杀基因系统在T 细胞中的作用,为在体内研究 YCD/5-FC 这一新型自杀基因系统在 GVHD 防治中的 作用打下基础。同时,重度aGVHD一旦发生,治疗极为困难,因此临床策略重在预 防。为了进一步优化临床预防 GVHD 的方案,我们设计了小剂量环孢素 A(CsA) 加短程氨甲喋呤(MTX)和霉酚酸酯(MMF)方案,并与传统的CsA加MTX方案 进行比较,观察其在临床GVHD预防中的效果。 一、NOD-SCID-hu 人鼠嵌合 GVHD 移植模型的建立:将健康供者经粒细胞集 落刺激因子(G-CSF)动员的外周血单个核细胞(MNC)按照2×107/只(A组)及5× 107/只(B 组)经静脉输注 NOD-SCID 小鼠体内,观察小鼠的 GVHD 临床表现和生 存时间,同时每周取小鼠静脉血,分离单个核细胞,通过流式细胞仪检测其中人 CD45+、CD3+及 CD4+细胞的比例,小鼠死亡之前或在接种后 60 天取其肝、脾、骨髓 和外周血,制备细胞悬液,检测其中人CD3+、CD4+、及CD45+阳性细胞比例,并进 行组织病理学检查,观察GVHD发生情况,对照组注射生理盐水,每组4 只小鼠。 结果:A、B两组小鼠均出现体重下降、弓背、苍白现象,无明显腹泻,平均生存时 间分别为42.7±12.0天和40.4±7.7天,而对照组均存活至60天,A、B两个移植组与 对照组相比,存活时间具有统计学差异,而A、B组之间差异无统计学意义。小鼠死 亡前,流式分别检测 A、B 两组小鼠肝脏、脾脏、骨髓及外周血细胞悬液中人 CD45+/CD3+/CD4+细胞的比例:A 组肝脏中人 CD45+/CD3+/CD4+细胞分别为 80.69±16.38%/73.32±11.06%/22.49±2.37%,脾脏中人 CD45+/CD3+/CD4+细胞分别为 75.88±14.58%/70.53±15.69%/20.46±1.49%、骨髓中人 CD45+/CD3+/CD4+细胞分别为 7PDF 文件使用 "pdfFactory" 试用版本创建 www.fineprint.com.cn<WP=9>第二军医大学博士研究生学位论文 中文摘要 9.64±1.83%/8.76±1.69%/1.50±0.16%,外周血中人 CD45+/CD3+/CD4+比例分别为 37.08±14.75%/ 34.43±16.42%/ 7.59±3.13%;B 组中肝脏中人 CD45+/CD3+/CD4+细胞分 别为84.7±14.06%/74.12±12.32%/24.44±2.85%,脾脏中人CD45+/CD3+/CD4+细胞分别 为81.72±16.06%/75.32±18.71%/20.44±7.15%、骨髓中人CD45+/CD3+/CD4+细胞分别为 10.51± 1.98%/8.59±1.59%/2.06±0.35%,外周血中人 CD45+/CD3+/CD4+比例分别为 50.23±15.07%/48.70±16.61%/12.47±7.24%。而对照组 NOD-SCID 小鼠的各器官悬液 中,无明显阳性人CD45+/CD3+/CD4+细胞。A、B两个移植组与对照组相比,各器官 中人 CD45+/CD3+/CD4+细胞比例具有统计学差异,而 A、B 组之间无统计学差异。 RT-PCR 均可检测到 A、B 两组小鼠骨髓中人 CD45 抗原的表达。病理切片中,A、B 两组小鼠都可见肝脏变化:有单个核细胞浸润,小肠、肾脏等其它器官未见明显改变。 对照组小鼠各器官未见异常。A、B两组小鼠GVHD的临床评分分别为3.88±0.48分 和4.25±0.29分,GVHD的病理评分分别为0.75±0.5分和1.25±0.5分,A、B组之间 差异无统计学意义,但与对照组相比具有统计学差异。结论:人外周血单个核细胞接 种NOD-SCID小鼠,能引起GVHD,且与供者T淋巴细胞有关。 第二:YCD/5-FC 自杀基因系统体内外功能检测:磷酸钙法转染瞬时包装细胞 Pheonix E,制备逆转录病毒 YCD-puro,用 YCD-puro 病毒“乒乓法”感染稳定产病 毒细胞株 PG13,加入 Puromycin 筛选阳性 PG13-YCD 细胞,建立稳定产 YCD-puro 包装细胞株。分离动员的人外周血单个核细胞,在抗人CD3+CD28抗体+IL-2刺激下 联合培养。三天后,转入 CH-296 预先包被的培养板,细胞接种密度 1×106/ml,加 入制备的YCD-puro病毒上清转染活化后的人T细胞,用PCR检测目的基因的转染, 并检测转基因 T 细胞的功能。结果:细胞因子联合刺激后 T 细胞明显扩增,在联合 刺激第6天时,T细胞可扩增45±5.4倍,细胞周期S期+G2-M期细胞比例由10.12±1.25 %增加到55.9±4.69%;YCD转基因效率为10-20%;PCR可检测到转基因YCD-T细 胞中YCD基因的存在。YCD-T细胞的增殖功能与正常培养细?