论文部分内容阅读
目的:原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大常见恶性肿瘤,近年来发生率及死亡率都有上升趋势。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染是肝癌发生的重要诱因之一,但HCV感染引起HCC的具体机制尚未完全阐明。HCV核心蛋白是HCV病毒编码产生的一种多功能蛋白,目前的研究表明核心蛋白通过与细胞内重要的转录因子或者信号通路相互作用,异常调控细胞内原癌基因或抑癌基因的转录,加快细胞生长、导致细胞恶性转化,干扰机体免疫防御功能,削弱宿主对HCV感染细胞的抗病毒应答,有利于丙型肝炎病毒慢性持续性感染的建立,最终促使HCV相关肝病的发生和发展。Wnt/β-catenin信号通路的异常活化在肝癌的发生过程中起着重要的作用。约50-83%的肝癌组织标本可以发现β-catenin的异常活化,其中因CTNNB1(β-catenin)基因突变等引起β-catenin的异常活化仅占20%左右,而AXIN1,AXIN2基因的突变较少见,结肠腺瘤样息肉基因(Adenomatous Polyposis Coli, APC)的失活突变至今未在肝癌组织中发现。提示肝癌发生过程中,Wnt/β-catenin信号通路的其它抑制性调控因子如分泌型卷曲蛋白(Secreted frizzled-related proteins, SFRPs)的异常表达,对Wnt/β-catenin信号通路的异常活化将起到重要的作用。甲基化修饰是SFRPs基因表达调控的重要方式之一,已有研究表明,SFRPs基因的高甲基化修饰与多种肿瘤的发生密切相关。在结肠癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肝癌等中都可发现SFRPs基因启动子区超甲基化修饰,而使其表达受到抑制。肝癌中SFRPs基因的高度甲基化能使其表达下调,从而导致Wnt信号通路异常活化,促进细胞异常增殖,参与HCC的发生。HCV核心蛋白能够直接诱导Wnt信号通路异常活化,然而核心蛋白能否在表观遗传水平调控SFRPs基因的表达,参与HCV相关肝病的发生,迄今为止国内外无相关报道。本实验拟在HCV核心蛋白过表达的细胞模型中观察核心蛋白能否影响SFRPs基因的表达,进而研究核心蛋白引起的SFRPs基因启动子区甲基化修饰改变,并深入分析核心蛋白调控SFRP1表观遗传修饰的分子机制,探讨HCV核心蛋白在HCV分子致病机制中的作用。方法:在核心蛋白过表达的细胞模型中,通过Real-time PCR及Western blot等方法检测SFRPs基因的表达。筛选到核心蛋白下调SFRPs家族中的SFRP1后,采用5′-氮-2′-脱氧胞嘧啶(DAC)对细胞进行去甲基化处理,观察SFRP1基因的表达是否能够恢复。通过甲基化特异性PCR(Methylation-specific,MS-PCR)以及亚硫酸盐DNA测序方法验证核心蛋白可促进SFRP1启动子区高甲基化修饰。进一步通过免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等技术研究核心蛋白对SFRP1基因表观沉默的分子作用机制。结果:在核心蛋白过表达的肝癌细胞系Huh7、HepG2以及稳定表达核心蛋白的Huh7-core中,Wnt信号通路抑制分子SFRP1的表达明显下调。在核心蛋白过表达的Huh7细胞中采用5′-氮-2′-脱氧胞嘧啶(DAC)对细胞进行去甲基化处理,Real-time PCR及Western blot结果表明SFRP1的表达能够部分恢复,并且SFRP1的表达恢复程度与DAC的浓度呈剂量依赖关系。甲基化特异性PCR以及亚硫酸盐DNA测序实验证实核心蛋白能够引起SFRP1基因启动子区高甲基化修饰。进一步研究核心蛋白下调SFRP1表达的分子机制发现:核心蛋白可以上调DNA甲基化转移酶1(DNMT1)和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)的蛋白表达,同时核心蛋白可招募DNMT1、HDAC1富集于SFRP1的启动子区,抑制乙酰化组蛋白H3(AcH3)结合于SFRP1启动子区,从而使SFRP1启动子区高甲基化修饰,抑制组蛋白乙酰化修饰,造成SFRP1基因的表达受抑制。结论:核心蛋白通过招募DNMT1、HDAC1富集于SFRP1启动子区,抑制AcH3结合于SFRP1启动子区,促进SFRP1启动子区高甲基化与组蛋白去乙酰化修饰,协同沉默SFRP1基因表达,参与HCV的分子致病过程。