【摘 要】
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L-乳酸脱氢酶底物谱广泛,对天然底物丙酮酸及其他多种α-酮酸具有不同的催化活性。L-乳酸脱氢酶催化α-酮酸得到的催化产物α-羟酸在医药、食物饲料、日化品等多行业都有很好的应用前景。因此通过理性设计,改变L-乳酸脱氢酶的活性口袋以提高其催化效率,具有重要意义。本研究从前期课题组筛选得到的Lf-LDH0845（Lactobacillus fermentum JN248,L-lactic dehydro
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L-乳酸脱氢酶底物谱广泛,对天然底物丙酮酸及其他多种α-酮酸具有不同的催化活性。L-乳酸脱氢酶催化α-酮酸得到的催化产物α-羟酸在医药、食物饲料、日化品等多行业都有很好的应用前景。因此通过理性设计,改变L-乳酸脱氢酶的活性口袋以提高其催化效率,具有重要意义。本研究从前期课题组筛选得到的Lf-LDH0845（Lactobacillus fermentum JN248,L-lactic dehydrogenase）出发,通过理性设计决定对该酶进行定点饱和突变,然后利用基因工程和PCR技术获得19个突变体,并对突变体进行底物特异性探究和分子对接,最后选择突变体Lf-LDH0845Y221F进行酶学性质的探究。论文的主要研究成果如下:（1）利用分子对接,确定了4个突变位点:Arg90、Tyr221、Ile224和Thr230。经过实验验证,最终选择对LDH0845的Tyr221进行饱和突变及后续探究。（2）Y221位点进行饱和突变后获得了19个突变体。对丙酮酸,突变体LDH0845Y221K、LDH0845Y221P、LDH0845Y221W的比活力是281 U?mg-1、284 U?mg-1、332 U?mg-1,较野生型提高了1.9、1.9、2.3倍。对3,4-二羟基苯丙酮酸,突变体LDH0845Y221F、LDH0845Y221S、LDH0845Y221I的比活力是42 U?mg-1、29 U?mg-1、28 U?mg-1,分别提高了3.4、2.3、2.3倍。突变体LDH0845Y221F、LDH0845Y221Q对苯丙酮酸的比活力分别为191 U?mg-1、208U?mg-1,提高了2.8、3.0倍。突变体LDH0845Y221F、LDH0845Y221P对对羟基苯丙酮酸的比活力为30 U?mg-1、27 U?mg-1,提高了1.9倍和1.7倍。对苯甲酰甲酸,19种突变体均对其表现出催化能力的降低。对乙醛酸,突变体LDH0845Y221A、LDH0845Y221F和LDH0845Y221G的比活力为65 U?mg-1、40 U?mg-1.、45 U?mg-1,分别提高了2.7、1.7、1.9倍。对4-甲基-2-氧代戊酸,突变体LDH0845Y221A的比活力为35 U?mg-1,仅为野生型的94%。而突变体LDH0845Y221F的比活力提高至52 U?mg-1,两种突变对催化产生了不同的影响。（3）突变体LDH0845Y221F对3,4-二羟基苯丙酮酸、4-甲基-2-氧代戊酸和乙醛酸的kcat值分别为1.21 s-1、1.35 s-1、0.72 s-1,分别是野生型的420%、150%、130%。突变体LDH0845Y221F对以上三种底物的Km值分别是4.78 m M、2.28 m M和2.04 m M,表现出更高的亲和力。LDH0845对三种底物的kcat/Km值分别为0.024、0.25和0.15 m M-1·s-1,而突变体LDH0845Y221F对三种底物的kcat/Km值分别为0.25、0.59和0.35 m M-1·s-1,催化效率提高。（4）突变体LDH0845Y221F催化3,4-二羟基苯丙酮酸的最适温度为25℃,最适p H为6.0。突变体LDH0845Y221F在温度低于20℃,p H值为4.5至6.5时仍残留了80%以上的酶活力。
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