细菌纤维素（Bacterial cellulose,BC）是由细菌合成的高分子生物聚合物,具有保水性高、结晶度高、可降解性强、生物相容性高、纯度高等优良特性,广泛应用于食品、医疗、化妆品、功能膜等领域。木葡萄糖酸醋杆菌（Komagataeibacter xylinus）是BC合成研究的模式菌株。该菌株可以利用葡萄糖、甘油、甘露醇等碳源合成BC,也可以利用糖蜜等复杂底物合成BC,具有高产量、低成本等优点。随着合成生物学的发展,越来越多的国内外学者成功利用代谢工程的手段改造醋酸杆菌,提高BC产量或改变BC结构。研究发现,细菌的运动相关基因与BC合成有关,在此基础上,我们利用CRISPR-Cas9技术成功敲除细菌运动相关基因motA、motB,构建了敲除菌株K.xylinus-ΔmotA、K.xylinus-ΔmotB、K.xylinus-Δmot2A、K.xylinus-ΔmotAB。之后,为了探究敲除基因与BC合成的关系,我们将敲除菌株进行发酵验证,结果表明:同时敲除基因motA和motB基因的敲除菌敲除菌K.xylinus-ΔmotAB的BC产量最高,达到6.87±0.17 g/L,与野生型菌株相比,提高44%左右;同时,该菌株合成的BC的孔隙率最低,达到了54.35%,并具有更优越的力学性能,杨氏模量显著提高,最高可达5211 MPa。此外,敲除运动相关基因对BC化学结构及网状结构并没有明显改变。由于目前针对BC合成模式菌K.xylinus开发的遗传操作工具仍比较少,因此,我们将传统的sacB介导的反向筛选敲除系统引入该菌,探索该系统的可行性。本研究首先利用卡那抗性基因和红色荧光蛋白编码基因mRFP以及枯草芽孢杆菌来源的携带sacB基因的pkR6k质粒构建基因敲入载体。首先用强启动子P06915替换卡那抗性基因原始启动子,构建强启动子的质粒pkR6k,在此基础上,将新构建的质粒pkR6k与同源臂连接,构建敲入载体及敲除载体,将质粒pkR6k与同源臂连接及mRFP基因连接,构建mRFP基因敲入载体。为了进一步提高重组效率,促进基因敲除及敲入的效率,我们将重组酶表达系统引入该质粒,优化质粒敲除系统从而为后续的敲除方法建立奠定基础。