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目的： 1．在摇瓶水平上对可影响大肠杆菌生长及外源蛋白表达的因素进行多因素分析，明确这些影响因素对菌体生长及表达的影响程度。 2．在BioFlo110型发酵罐中摸索高密度发酵方法，确定合理的发酵路线； 3．探索具有可放大的、非特异性纯化目的抗体片段的工艺路线。 方法： 1．通过预实验及文献回顾，确定出需实验考察的可能影响大肠杆菌生长及外源蛋白表达的8个因素。采用Plackett-Burman多因素两水平分析法和Box-Behnken响应面分析法对这8个因素进行多因素交互作用的实验设计，随后按照设计要求在摇瓶水平上进行实验； 2．在BioFlo110型发酵罐中考察不同的补料模式可能实现的发酵水平及蛋白表达水平。考察3种补料模式：恒速补料、指数补料及溶氧反馈控制补料。 3．在纯化路线设计方面，先以经过Ni2+敖合层析的抗体为“标准品”，摸索阳离子交换柱和疏水层析柱的纯化条件；随后按照自行设计的组合层析策略，将获得的菌体冻融上清经预处理后按照弱阳离子CM柱、疏水phenyl柱及凝胶过滤S200柱的顺序依次纯化；最后将得到的抗体以非竞争性ELISA法测定与乙肝表面抗原的亲和活性。 结果： 1．在对影响基因工程重组菌Fab／pBAD／gⅢ TOP10生长特性的多因素分析中，对可能影响菌体生长的8因素两水平分析后重要性排列的结果依次为：发酵起始pH、微量元素、体系载液量的水平、培养初期体系葡萄糖浓度、摇床转速、发酵过程的温度控制、培养体系中乙酸水平、以及诱导剂对生长过程的影响。其中，控制培养体系的pH值及微量元素的含量对生长影响最重要。对可能影响重组菌表达特性的3因素多水平分析的结果表明:诱导剂作用的浓度、诱导时间以及两者的交互作用对目的抗体表达的影响最重要。考察恒速补料、指数补料及溶氧反馈控制补料3种补料方式对发酵及表达效果的结果表明:从获得的菌量来看，以溶氧反馈控制补料模式获得的菌体量最高，可达OD55.8左右（相当于湿菌重128岁L），发酵的时间最长，达10个小时，获得的抗体产量最高，达到125m叭（发酵液）水平。但是从产率来看，恒速补料的单位菌体产率可达1.23m留g，单位时间内的产率为13.48m留g。结合考虑发酵过程中的氧耗成本及补料成本进行综合分析，很难从单一指标断定哪种补料模式为最佳。从我们实验室的发酵罐的硬件配置来看，最优的选择似乎是恒速补料，尽管该模式的总体产量较低，但是其单位菌体产率及单位时间的产率较高，同时操作最简单而消耗的成本又最小。在纯化路线的设计中，我们以经过Ni2+敖合层析纯化的Fab为替代标准品，先后确定了CM柱及HIC柱的纯化条件，证实了采用CM柱及HIC柱的可行性。随后将预处理后的冻融上清顺次过CM层析柱、HIC柱及GF柱纯化，比较理想地获得了目的抗体。-在随后的重复实验中，我们测定了各个色谱柱的纯化效率，对于以替代标准品直接过柱而言，CM柱及GF柱的目的抗体纯化效率可以达到90%左右，而HIC柱则接近80%，整体效率约65%左右。抗原结合活性测定方面，我们采用的是非竞争性EUSA法，计算出Fab亲和常数在107一1护M一，水平，比完整抗体anti一HBsAgIgG亲和常数（108一1护M一‘）小约1一2个数量级，表明该Fab抗原结合能力较强，在经过3个层析柱的纯化后仍可以保持较好的抗原结合活性。结论: 我们在摇瓶水平上确定了能够影响宿主菌生长的最重要因素为培养一3一体系的pH值及微量元素的含量，可影响宿主菌表达目的抗体的重要因，素为诱导剂作用的浓度、诱导时间以及两者的交互作用;在发酵罐发酵水平上，比较了不同的补料发酵模式可以实现的工程菌高密度发酵及高效表达的水平，从我们实验室的发酵罐的硬件配置来看厂，最优的选择是恒速补料，尽管该模式的总体产量较低，但是其单位菌体产率及单位时间的产率较高，同时操作最简单而消耗的成本又最小;在纯化工艺探索方面，完成了以组合层析策略（弱阳离子CM、疏水柱phenyl以及凝胶过滤5200）纯化目标抗体路线的构建。实验结果表明，采用我们构建的发酵方法及纯化路线，获得的抗体产量及成本均比较满意，且活性良好。 我们的实验从实验室水平向工业生产过渡的角度，完成了anti一HBsAg Fab/P BAD/gl n TOPlo原核表达体系的大规模培养及目的抗体批量纯化工艺路线的构建，为基因工程抗体的表达和纯化从实验室水平向工业化生产的过渡奠定了基础。