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背景:肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是常见人类致病菌,感染后可引起肺炎、中耳炎、脑膜炎等疾病。近年来,肺炎链球菌临床菌株耐药率不断上升,导致肺炎链球菌感染性疾病的发病率逐年升高。临床上主要采用β-内酰胺类抗生素治疗肺炎链球菌感染相关疾病,其作用的靶分子是细菌表面青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs),PBPs突变是肺炎链球菌耐药的主要机制。PBPs是细菌细胞壁主要组分肽聚糖合成相关的酶类,其转肽酶功能结构域(domain)中有SXXK、SXNVP和KS/TG三个基序(motif),也是β-内酰胺类抗生素与PBPs结合位点,上述基序突变可使细菌与β-内酰胺类抗生素的亲和力下降甚至消失,从而使细菌产生耐药性。此外,近年文献及我们以往研究结果提示,可能存在低浓度β-内酰胺类抗生素诱导肺炎链球菌PBPs表达下调,从而使细菌产生耐药性的非PBPs依赖耐药机制。 目的:了解本地区肺炎链球菌临床菌株对青霉素G和头孢菌素的耐药率、优势流行的血清型以及血清型与耐药关系。确定β-内酰胺类抗生素敏感肺炎链球菌PBPs中SXXK、SXNVP和KS/TG基序序列。明确肺炎链球菌临床菌株PBPs中SXXK、SXNVP和KS/TG基序突变与耐药关系。了解低浓度青霉素G和头孢菌素诱导肺炎链球菌pbps-mRNAs水平下调的作用。 方法:采用E-test测定青霉素G和头孢噻肟对本地区分离的肺炎链球菌临床菌株最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。采用多重PCR及荚膜抗血清乳胶凝集试验对肺炎链球菌临床菌株进行血清学分型。采用常规PCR及产物测序了解肺炎链球菌临床菌株6个pbps基因序列。采用NCBI数据库中Conserved Domain Database(CDD)软件分析并确定β-内酰胺类抗生素敏感肺炎链球菌PBPs中SXXK、SXNVP和KS/TG基序序列。采用生物信息学方法了解肺炎链球菌临床菌株PBPs中SXXK、SXNVP和KS/TG基序突变与耐药性关系。采用实时荧光定量RT-PCR检测1/4或1/8 MIC青霉素G或头孢噻肟作用前后对肺炎链球菌pbps-mRNAs水平变化。 结果:27株肺炎链球菌临床菌株中,59.3%菌株(16/27)对青霉素G耐药,51.9%菌株(14/27)对头孢噻肟耐药。27株肺炎链球菌临床菌株中,多重PCR检出20株6个血清型:7株19F型、4株19A型、4株3型、2株6A/B型、2株23F型、1株18C型,荚膜抗血清乳胶凝集试验能将21株分为3个血清型组(pools),两种方法血清分型率(74.1%和77.8%)无显著性差异(p>0.05),但多重PCR血清分型远较乳胶凝集试验精细。所有7株19F血清型肺炎链球菌临床菌株中有5株对青霉素G和头孢噻肟均耐药。肺炎链球菌R6株和ATCC6306株PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2b、PBP2x和PBP3序列中均含有SXXK、SXNVP、KT(S)G三个基序。所有受检青霉素G和头孢噻肟耐药肺炎链球菌临床菌株PBP1b、PBP2a、PBP2b和PBP3中SXXK、SXNVP、KT(S)G基序序列均未发生突变。但上述耐药菌株PBP1a和PBP2x基序序列均发生突变,其主要突变形式为PBP1a中STMK基序T371A突变以及SRNVP基序P432T突变、PBP2x中STMK基序T338A和M339F突变。1/4或1/8 MIC青霉素G或头孢噻肟作用后,多数耐药或敏感肺炎链球菌临床菌株pbps-mRNAs水平明显下降(p<0.05),少数菌株pbps-mRNAs水平先升后降、明显升高、先降后升(p<0.05)或无显著差异(p>0.05)。 结论:本地肺炎链球菌临床菌株对青霉素G和头孢噻肟均有较高耐药率。19F是优势流行的肺炎链球菌血清型且大部分对青霉素G和头孢噻肟耐药。耐药肺炎链球菌临床菌株PBP1b、PBP2a、PBP2b和PBP3中SXXK、SXNVP、KT(S)G基序序列均未发生突变,但PBP1a和PBP2x基序序列均发生突变,主要表现为PBP1a中STMK和SRNVP基序突变单位点突变联合PBP2x中STMK基序双位点突变。低浓度青霉素G和头孢噻肟可诱导多数肺炎链球菌临床菌株pbps-mRNAs水平下调。