Ⅱ型限制性内切酶含有一个可以识别DNA双链并能与之结合的识别功能域,及一个剪切DNA链的催化功能域。目的：将Ⅱ型限制性内切酶FokI催化区域基因和PI-SceI识别区域的基因连接到一起,克隆入载体质粒pET28a+中,为表达新的限制性内切酶融合酶做准备。方法：分别以酿酒酵母和黄杆菌为模板,PCR扩增制备FokI的催化区域基因和PI-SceI识别区域的基因,再将它们克隆入载体质粒pET28a+。结果：FokI催化区域基因大小为631bp, PI-SceI识别区域的基因大小为546bp。基因整合的过程中,无论是PI-SceI还是FokI的基因片段,都能成功的单独插入载体,并可以正确的指导表达20000Da以上的蛋白产物,但当将任何一段基因插入到已整合了另一段基因的整合质粒后,PCR及双酶切检测结果显示,插入的基因片段中大约有600bp的碱基序列缺失了。进一步检验中发现,两段基因片段都不会被实验中所用的内切酶酶切,对整合质粒进行测序后,结果显示缺失的部分主要是FokI的基因片段,并且几乎全部丢失,但PI-SceI基因保存完好。而之后两段基因在体外连接时的PCR检验结果发现,电泳条带发生弥散,并且集中在250bp～500bp的范国内。结论：基因片段连接克隆入载体时,基因片段发生缺失。整合的基因片段的缺失可能因为在转化过程中宿主细胞对两段组合在一起的新基因产生了排斥,该组合基因对细胞有毒性,宿主细胞对其进行了剪切；而后两段摧因连接后PCR检验说明缺失现象也可能是因这两段基因连在一起会形成某种高级结构而导致其不能很好的连接而造成的；另外也有极小的可能是连接基因自身剪切而发生缺失。