微生物油脂,又称单细胞油脂,由产油微生物产生,在组成成分上类似植物油。美国国家可再生能源实验室(NREL)的报告曾特别指出,微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。而能否采用廉价的原料和合适的生产方式来降低成本是微生物油脂生产能否规模化、产业化的关键点之一。本文对废弃秸秆发酵转化微生物油脂的两种技术策略进行了研究。其中在秸秆-微生物油脂转化的多菌种分步发酵研究中,侧重于小麦秸秆糖转化率提高的关键技术研究,选择以“设计具有高效秸秆糖化能力的酶系生产混菌体系”为研究方向。此后,考虑到多菌种分步发酵过程繁琐,多菌种发酵控制复杂等问题,提出了一步法发酵转化(CBP)纤维素生产微生物油脂的策略。在获得多株能直接转化木质纤维素材料为微生物油脂的菌种的基础上,建立了CBP微生物油脂发酵体系。随后,以Aspergillus oryzae A-4和Penicillium sp. P-2为主要研究对象,进行了发酵优化、CBP行为分析和遗传改造等研究。论文的主要研究结果如下：(1)具有高效秸秆糖化能力的酶系生产混菌体系的设计及特性研究：采用正交试验和统计分析辅助进行高效混菌体系的人工设计,获得了一组高效的纤维素酶生产菌系Consortium-APcT2。Consortium-APcT2由Trichoderma sp. T-1、P. chrysosporium和A. oryzae A-4构成,其比例为92:6.7:1.3。Consortium-APcT24天发酵后获得的酶系能在20小时内,将1g碱预处理秸秆转化为805.12mg的可发酵糖,对粗纤维的转化率为85%左右。与单菌中产酶效果最好的Trichoderma sp.T-1相比,转化率提高了26.98%。混菌组合Consortium-APcT2的性质研究结果表明,Consortium-APcT2具有高效秸秆糖化能力的酶系生产能力的原因有：1)A. oryzae A-4, P. chrysosporium和Trichoderma sp. T-1的相互作用增加了胞外木质纤维素降解相关酶系的分泌,特别是β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶；2)不同菌种分泌的纤维素酶酶系在水解过程具有协同作用。最后,以Consortium-APcT2为发酵菌剂设计纤维素酶生产和秸秆水解连续反应制备可发酵性糖液用于Zfermentans发酵生产微生物油脂,油脂产量可达2.3g1-。而在相同发酵条件下,以小麦秸秆硫酸水解液为底物获得的油脂产量仅为1.7g l-1.(2)纤维素-微生物油脂转化(CBP)的单菌株一步发酵菌种的筛选：采取从纤维素降解菌中筛选和从植物内生真菌中筛选两种不同策略分离可以一步法转化纤维素类底物高产三酰甘油酯的发酵菌种。纤维素降解菌米曲霉(A-4)、青霉(P-2)和木霉(KmG-1)的油脂积累能力较强,胞内油脂含量分别为21.50%,17.50%和11.22%。从油料作物木油桐及西川朴中筛选得到具有纤维素降解和油脂高积累能力的内生真菌Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fungal endophyte sp和Mucor sp.,其中Fusarium oxysporum胞内油脂含量为26.60%,Fusarium solani为29.75%。(3) Penicillium P-2纤维素油脂转化及液态CBP发酵行为研究：综合各菌株的胞内油脂积累和固体秸秆培养基中的生长能力,选择Penicillium P-2进行后续发酵研究。液态发酵纤维素粉和固态发酵秸秆麸皮混合物的实验结果表明Penicillium P-2可以用于秸秆的微生物油脂转化,其在液体发酵和固态发酵条件下可达到的最高油脂产量分别为0.65g/1和40.13mg/gds。Penicillium P-2固态发酵秸秆麸皮混合物生产微生物油脂的最优条件为：起始料水比4:2,pH6,发酵温度30℃, Tween-800.2%。对液态发酵后所得到的油脂产量和纤维素酶酶活力的相关分析结果表明P-2的纤维素酶分泌能力会影响油脂生产。外源纤维素酶添加实验证实提高培养基中纤维素酶活力以增强可发酵糖类的含量可以提高P-2的油脂积累和生长。添加24FPU/gds的纤维素酶使得P-2发酵后的最高油脂产量达到0.83g/1。(4) Aspergillus oryzae A-4固态发酵秸秆麸皮混合物的微生物油脂生产及发酵优化：尽管Penicillium P-2的纤维素降解能力和油脂积累能力都很强,但是其利用秸秆发酵获得的微生物油脂产量并不可观。因此,对另一株在固体秸秆培养基中生长最旺的菌株A. oryzae A-4进行研究。以纤维素为唯一碳源进行液态发酵,A-4可在胞内积累15%-18.15%的油脂。随后,以固态发酵秸秆麸皮混合物为主要研究方式,开展了CBP行为研究和发酵优化,推测了菌株A-4转化固体秸秆积累油脂的大致过程。研究结果表明,A-4在不添加纤维素酶的条件下,固态发酵秸秆麸皮混合物最高可生产单细胞油脂(SCOs)62.87mg/gram dry substrate(gds);纤维素酶可影响A-4的油脂产量；共发酵秸秆与其他工农业废弃物也可以提高A-4的油脂生产。(5)纤维素酶基因在A-4中的插入表达及高效产油重组菌的筛选：基于纤维素酶对CBP油脂生产的影响,对油脂生产较强的A-4进行基因工程改造。采用重叠PCR和同源重组技术,以A. oryzae RIB40的hlyA启动子、淀粉酶表达框的终止子和带PT抗性基因的质粒pPTRI为元件,构建了能够在产油A. oryzaeA-4中表达外源基因的重组载体pPTRI-Tamy-gene。在经过eGFP蛋白验证了所构建的遗传表达系统的可行性后,以来源于A. oryzae RIB40基因组的4种纤维素酶基因celA,celB,celD,celC为目的片段,构建了纤维素酶表达A-4载体。成功转化A.oryzae A-4后,通过PCR验证和液态发酵秸秆实验筛选获得5个纤维素酶活力大大提高的阳性转化子。其中A2-2和D1-B1在液体发酵和固态发酵条件下可产生大大高于WT的油脂产量。在无优化的固态发酵条件下,转化子Dl-Bl在发酵4天即可达到最大油脂产量63.30mg/gds。发酵特性对比实验表明外源基因插入表达抑制了D1-B1和A2-2菌体生长,但可促进油脂积累。这种插入基因对菌体生长代谢的抑制效应在以纤维素类底物为碳源可以被屏蔽或减弱。