松弛素家族在生殖学领域受到关注,哺乳类RLN3是一种新型的松弛素家族成员,在脑和睾丸中表达。迄今为止,关于RLN3生物学功能的报道,主要作为一种神经肽参与脑部的神经调节:如应激反应、激励、主动性、调节摄食活动等。小鼠的RLN3基因敲除导致其焦躁不安,忧虑多动,因而RLN3长期以来作为一种神经肽,治疗神经疾病,如抑郁症等。硬骨鱼类出现了rln3复制基因:rln3a和rln3b,其中rln3a是脊椎动物中rln3的直系同源基因,本课题组的前期研究基础表明rln3a在罗非鱼脑和精巢中有较高的表达水平,但迄今为止未见关于rln3参与脊椎动物生殖调控的报道。为了揭示rln3a在硬骨鱼类精子发生过程中的作用,本研究以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为实验对象,设计了一系列的实验进行证明。罗非鱼是重要的世界性养殖鱼类,它的性别决定类型是XX和XY型,其单性鱼苗很容易获得,我们实验室已完成对罗非鱼性别分化不同发育时期(孵化后5、30、90、180天)雌雄性腺的转录组测序,深入研究了类固醇激素(11-KT和DHP)、生长因子(IGF3和AMH等)、转录因子(Dmrt1和Sf1等)对罗非鱼精子发生过程的调控,建立了罗非鱼的基因敲除平台,这些工作使得罗非鱼成为研究硬骨鱼类育性的良好实验动物。在本研究中,我们在获得rln3a突变F0代个体的基础上,筛选到F1代rln3a的突变个体,深入研究该基因突变影响精巢分化、精子发生的分子机制。首先通过免疫组化、H.E.染色、流式细胞仪和电镜等方法研究了rln3a突变对精巢组织结构、精子发生和育性等过程的影响。其次,分别对rln3a突变个体和对照鱼的脑和性腺组织进行转录组分析,在脑和性腺中筛选出一系列显著差异表达基因。最后通过Realtime PCR和免疫组化验证了rln3a突变前后这些基因在性腺中的表达模式,阐明了rln3a影响罗非鱼精子发生的分子机制。我们得出的研究结果归纳如下:1)对已获得的F0代rln3a基因突变个体饲养至性成熟,通过F0代突变雄性个体与正常雌性个体受精得到F1代。运用H.E.染色对3月龄F1代rln3a基因突变的罗非鱼个体进行组织学观察,结果发现rln3a基因突变个体的性腺中精子发生启动延迟,与对照组相比未发现初级和次级精母细胞等各级生精细胞。免疫组化实验未检测到雄激素(Cytochrome P450,family 11,subfamily C,polypeptide 1,11-KT)合成酶(Cyp11b2)的表达。另外,通过抗增殖细胞核抗原(PCNA)染色发现在rln3a突变的精巢中的表达水平显著低于对照组的精巢。因此,我们推测rln3a基因的突变影响罗非鱼精子发生的启动和精原细胞的增殖。2)通过H.E.染色发现rln3a基因突变成鱼的精巢精小叶紊乱,几乎未见精子细胞和成熟精子。通过扫描电镜发现rln3a基因突变个体的精巢出现空腔,精巢的横切面积和精子数量显著低于对照组。通过透射电镜发现在rln3a基因突变鱼的性腺中未发现成熟精子,但与对照组个体相比,rln3a基因突变鱼未影响精巢中精母细胞的分化。3)通过F1代rln3a基因突变成鱼与正常XX个体受精实验发现,胚胎到受精后2天(囊胚期)几乎全部死亡,表明rln3a基因突变个体不能正常受精。分别取rln3a基因突变鱼和正常罗非鱼的精液,用流式细胞仪和电脑辅助的精子分析仪进行相应的测定,发现rln3a基因突变个体的精子体积(FSC)和细胞内复杂程度(SSC)显著低于对照组。精子活力测定结果显示,rln3a基因突变个体的精子活力相关参数(平均直线、曲线运动速度、精子活力、精子浓度)显著低于对照组。通过对血清中激素水平的测定发现,rln3a基因突变个体血清中11-KT、FSH和LH的水平显著低于对照组XY个体。4)为了进一步研究rln3a基因突变对罗非鱼个体的影响,我们分别对rln3a基因突变和对照组个体的脑和性腺进行转录组测序。在脑和性腺中筛选出rln3a基因突变前后显著差异表达的基因,并且对这些差异表达基因进行GO和KEGG的分析。最后通过Real-time PCR验证了这些基因在rln3a基因突变前后性腺中的表达模式,进而阐明了rln3a突变影响罗非鱼的精子发生和育性过程的分子机制。综上所述,本研究通过基因敲除和转录组技术,系统研究了rln3a突变对罗非鱼精巢分化、精子发生启动、精子发生过程和雄性育性等过程的影响,阐明了基因突变影响精巢分化、精子发生的功能和分子机制。