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热休克蛋白90(Heat shock protein90,Hsp90)是细胞内含量极其丰富且分布广泛的分子伴侣蛋白,它的客户蛋白(client proteins)多是细胞内信号转导通路的关键蛋白,因而在控制细胞周期、细胞存活、激素水平及其他信号通路中起着重要的作用,并与肿瘤的发生、发展密切相关。如果阻断Hsp90的功能将同时介导这些客户蛋白经泛素蛋白酶体通路降解,从而起到“一靶多效”的作用。Hsp90因此已成为癌症治疗的重要靶点。
真菌环氧二烯(Mycoepoxydiene,MED)是来自于海洋微生物的聚酮类化合物,结构新颖,有较强的抗肿瘤活性。前期研究发现MED是Hsp90的抑制剂,并且已对MED抑制Hsp90引起HeLa细胞凋亡的分子机制进行了研究。然而,有关MED抑制肿瘤细胞增殖的特异性、MED对Hsp90及其客户蛋白基因的调控水平、MED对细胞增殖信号通路MEK/ERK的激活及其对细胞自噬存活的影响尚不清楚。
本论文通过MTT和Western Blotting的方法,首先对MED抑制的肿瘤细胞增殖与Hsp90客户蛋白质下调的特异性开展研究,再通过实时定量PCR、RNA干扰、流式细胞术等方法,研究MED抑制增殖敏感的HeLa细胞中MEK信号通路的激活与细胞增殖及其细胞自噬的影响。得到了以下有意义的结果:
1) MED可以有效抑制HeLa、MDA-MB-435、H1299、LnCAP和SW480等多种肿瘤细胞的增殖,其IC50值介于15μmo l/L至30μmo l/L之间。MED对不同的肿瘤细胞具有不同的抑制作用,其中HeLa细胞对MED的增殖抑制作用最敏感;
2)MED在细胞水平上对肿瘤细胞Hsp90的抑制作用与抑制肿瘤细胞增殖呈正相关,表现在对增殖抑制敏感的肿瘤细胞中(如HeLa)其客户蛋白Akt、IKKα、IKKβ、IKKγ的下调越明显;
3)经过Real-time qPCR分析发现,HeLa细胞经MED处理后Hsp90客户蛋白Akt、IKKα、IKKβ、IKKγ的RNA水平上的表达与阴性对照组差异不大;
4) MED抑制HeLa细胞增殖却激活MEK/ERK信号通路,抑制MEK/ERK通路的激活并不能促进细胞增殖。同样,shRNA降低MEK1的表达水平后,也不能促进细胞增殖。MEK1的表达水平降低基本没有改变MED对细胞周期的影响,也没有改变细胞周期蛋白的变化;
5)自噬是使细胞存活的一种方式。MED对HeLa细胞的自噬具有一定的影响,经MED处理后的HeLa细胞内LC3-Ⅱ没有发生聚集到自噬溶酶体的现象。
根据上述结果得到以下研究结论(1) MED对不同肿瘤细胞抑制强度不同,具有一定的选择性。HeLa细胞对MED的增殖抑制较敏感;(2) MED在细胞水平上对肿瘤细胞Hsp90的抑制作用与抑制肿瘤细胞增殖呈正相关;(3) MED对Hsp90及其客户蛋白的基因的转录调控不明显,对相关基因的表达调控主要发生在蛋白质水平的下调作用;(4)MED激活MEK/ERK信号通路,并不能促进HeLa细胞增殖;(5) MED对HeLa细胞的自噬具有独特影响,表现在先诱导后抑制的趋势。
本研究结果对真菌环氧二烯类化合物开发成新的抗癌药物以及将其作为小分子探针,揭示肿瘤细胞的内在规律均具有较为重要的意义。