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背景:癫痫患者易合并其他精神或神经疾病称为癫痫共患病。癫痫共患病在癫痫患者中十分常见,30~50%的癫痫患者可受累。现代癫痫病的治疗不仅局限于痫性发作的控制,近年来癫痫共患病的治疗与预防已成为癫痫领域的关注热点。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)起源于海马、海马旁回、杏仁核以及外侧颞叶新皮质,是临床最常见的癫痫综合征。海马硬化是TLE最常见的病因及病理改变。认知功能障碍是TLE常见癫痫共患病,严重影响患者的生活质量,具体机制不清。研究表明环腺苷酸反应元件结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)活化的神经元优先参加记忆形成。氧化应激及线粒体功能损伤被认为是许多退行性神经系统疾病的主要发病机制,如阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆等。本研究试图揭示CREB在线粒体氧化应激导致TLE认知功能障碍中的作用。目的:探讨CREB在线粒体氧化应激中的作用以及CREB在线粒体氧化应激导致TLE认知功能障碍中的作用机制,为寻找TLE认知功能障碍新的治疗靶点提供思路和方向。方法:(1)细胞水平:分离出生24h的C57乳鼠海马神经元行原代培养,应用免疫荧光对海马神经元进行鉴定。将构建的CREB表达空载、干扰空载、表达载体及干扰载体转染至培养的神经元。细胞实验分为六组:空白对照组、转染CREB表达空载组、转染CREB干扰空载组、转染CREB表达载体组、转染CREB干扰载体组与Mito Q组。ELISA检测各组神经元SOD及MDA的水平。Western blot检测PKA、Ca MKIV、CREB、p CREB、arc及c-fos蛋白表达。q RT-PCR检测Ca MKIV、CREB、arc、c-fos m RNA表达。线粒体膜电位检测神经元凋亡率。流式细胞术检测神经元活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平。(2)动物水平构建匹罗卡品诱导的小鼠TLE模型。动物实验分为五组:空白对照组、假处理组、模型+生理盐水组、模型+CREB基因抑制剂666-15组、模型+Mito Q组。各组小鼠均行水迷宫行为学实验。ELISA检测CA1 SOD及MDA的水平。免疫组化检测CA1 Ca MKIV、CREB、arc、c-fos、PKA、p CREB组织蛋白表达。Western blot检测CA1 PKA、Ca MKIV、CREB、p CREB、arc及c-fos蛋白表达。q RT-PCR检测CA1 Ca MKIV、CREB、arc、c-fos m RNA表达。线粒体膜电位检测CA1神经元凋亡率。结果:成功分离、原代培养并鉴定海马神经元,并成功构建CREB表达载体和干扰载体。ELISA显示表达载体组SOD水平与对照组无差异,干扰载体组SOD水平低于对照组及表达载体组(P<0.05)。MDA水平表达载体组低于对照组(P<0.05),干扰载体组高于对照组(P<0.05)。Western blot显示CREB干扰载体能够抑制PKA、Ca MKIV、CREB、p CREB、arc及c-fos的蛋白表达。q RT-PCR显示CREB干扰载体能够抑制Ca MKIV、CREB、arc及c-fos的m RNA表达(P<0.05)。线粒体膜电位显示表达载体组与对照组相比能抑制神经元凋亡(P<0.05),干扰载体组与对照组相比能促进神经元凋亡(P<0.05)。流式细胞术显示干扰载体组ROS水平增加。流式细胞术ROS检测显示干扰载体组ROS水平高于对照组及表达载体组(P<0.05),表达载体组ROS水平低于对照组(P<0.05)。成功构建TLE动物模型。水迷宫实验中,定位航行试验显示模型+666-15组的潜伏期长于对照组及模型+生理盐水组(P<0.05)。空间搜索试验中模型+666-15组原平台周围停留时间短于对照组、模型+生理盐水组及模型+Mito Q组(P<0.05)。动物实验ELISA结果显示模型+生理盐水组、模型+666-15组SOD水平低于对照组(P<0.05),且模型+666-15组低于模型+生理盐水组(P<0.05)。模型+生理盐水组SOD水平低于模型+Mito Q组(P<0.05)。模型+生理盐水组、模型+666-15组MDA水平高于对照组(P<0.05),且模型+666-15组高于模型+盐水组。模型+生理盐水组MDA含量高于模型+Mito Q组(P<0.05)。免疫组化显示Ca MKIV、CREB、arc、c-fos、PKA、p CREB CA1组织蛋白的表达情况,Model+666-15组各蛋白表达量减少,Model+Mito Q组各蛋白表达较Model+666-15组增多。Western blot显示模型+666-15组能抑制Ca MKIV、CREB、arc、c-fos、PKA、p CREB蛋白表达。q RT-PCR显示模型+666-15组Ca MKIV、CREB、arc、c-fos m RNA表达低于对照组(P<0.05)。模型+Mito Q组上述各m RNA表达高于模型+666-15组(P<0.05)。线粒体膜电位显示模型+生理盐水组、模型+666-15组神经元凋亡率高于对照组,且模型+666-15组高于模型+生理盐水组(P<0.05)。模型+生理盐水组神经元凋亡率高于模型+Mito Q组(P<0.05)。结论:(1)下调神经元CREB表达能够引起神经元凋亡,ROS水平增加,抗氧化剂Mito Q能抑制神经元凋亡及ROS的水平。上调神经元CREB表达抑制神经元凋亡,ROS水平下降。CREB参与神经元线粒体氧化应激病理生理过程。(2)在TLE小鼠模型中,线粒体氧化应激参与TLE认知损伤,Ca MKIV-CREB信号通路受损。抑制CREB可使氧化应激水平增加,神经元凋亡增加,认知损伤加重。CREB参与线粒体氧化应激导致的TLE认识功能损伤。