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目的:1.采用重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)分别作用于人白血病细胞株K562、胃癌细胞株BGC-823后,检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)基因nRNA及蛋白表达的变化,初步探讨VEGF与肿瘤细胞多药耐药(MDR)之间的关系。2.构建含MRP1基因启动子的重组荧光素酶报告基因载体,并检测其在VEGF作用下转录活性的改变。3.从MRP1基因转录调控入手,分别检测Akt, p-Akt,转录因子SP1的蛋白表达水平以及SP1与DNA的结合活性,初步探讨VEGF上调MRP1的机制。4.构建含MRP1基因启动子区SPl结合位点突变序列的重组荧光素酶报告基因载体,并检测其在VEGF作用下转录活性的改变。方法:1.不同浓度的VEGF分别作用于肿瘤细胞24h后,应用SYBR GreenⅠ荧光染料,采用qRT-PCR检测各组细胞MRP1 mRNA的表达情况,根据标准曲线计算出MRP1 mRNA表达量;免疫印迹法(Western blot法)分别检测各组细胞MRP1蛋白表达水平。2.合成MRP1基因启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体PGL3-Basic中(PGL3-Basic-MRP1w);用脂质体2000将重组的报告基因载体与内参质粒p-半乳糖苷酶(β-gal)瞬时共同转染人胃癌BGC-823细胞,荧光素酶活性分析VEGF作用后MRP1基因启动子活性的改变;继之,采用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002预处理转染的细胞,再检测VEGF对MRP1基因启动子转录活性的影响。3.同样选取人胃癌BGC-823细胞为模型,分三组:一组常规培养24 h,另一组采用VEGF作用24 h,最后一组LY294002预处理1 h后再加VEGF作用24 h,Western blot法分别检测各实验组MRP1、Akt、p-Akt及SP1蛋白表达水平,凝胶迁移滞后实验(EMSA)方法检测各实验组转录因子SP1与DNA的结合活性。4.构建含MRP1基因启动子区SP1结合位点突变序列的重组荧光素酶报告基因载体(PGL3-Basic-MRP1m),脂质体2000将重组的报告基因载体与内参质粒β-半乳糖苷酶(β-gal)瞬时共同转染人胃癌BGC-823细胞,荧光素酶活性分析突变后的MRP1基因启动子活性的改变及VEGF对其转录活性的影响。结果:1.qRT-PCR结果显示:在K562细胞株及BGC-823细胞株中,VEGF均能上调MRP1 mRNA的表达,且呈较好的量效关系,VEGF 32 ng/mL组MRP1 mRNA表达量分别为未处理组的2.0倍、3.5倍(P<0.01);Western blot发现MRP1蛋白表达与其mRNA表达水平变化基本相一致。2.酶切鉴定和DNA序列分析表明成功的构建了重组PGL3-Basic-MRP1w荧光素酶报告基因载体;荧光素酶活性分析表明重组的报告基因载体在BGC-823细胞中具有启动子活性(144±6.888),是空载体PGL3-Basic转录活性(60±4.910)的2.4倍,差异有统计学意义(P<0.01);VEGF作用12 h后能以剂量依赖的方式上调MRP1启动子区的转录活性(r=0.944,P<0.01),与无VEGF作用组(171±6.083)相比,VEGF 32ng/mL作用组转录活性(924±19.975)增高4.4倍(P<0.01);PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002能够显著抑制VEGF对MRP1启动子区的转录激活,当LY294002浓度为50μmol/mL时,MRP1启动子活性(392±25.541)与无LY294002作用组(1001±11.533)相比下降60.8%(P<0.01)。3.VEGF 32ng/mL作用24 h组与未处理组相比,MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均上调,且转录因子SP1的活性明显增强;LY29400250μmol/mL预处理1h再联合VEGF 32 ng/mL作用24 h后,与VEGF 32ng/mL单独作用组相比,MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均下调,转录因子SP1的活性明显减弱。4.荧光素酶活性分析表明在BGC-823细胞中,PGL3-Basic-MRP1m具有启动子活性(110±2.603),其转录活性为空载体PGL3-Basic的1.8倍,差异有统计学意义(P<0.01),但与PGL3-Basic-MRP1w(144±6.888)相比,其转录活性下降23.6%(P<0.05);VEGF作用12 h后,其活性增强,且呈剂量依赖关系(r=0.911,P<0.01),VEGF作用浓度为32ng/mL时达最大值(191±14.799),与无VEGF作用组(112±11.358)相比,活性增高0.7倍(P<0.01);VEGF作用24 h后,也能以剂量依赖的方式上调SP1结合位点突变后MRP1启动子区的转录活性(r=0.945,P<0.01),与无VEGF作用组(133±6.083)相比,最大活性(426±7.000)增高2.2倍(P<0.01)。结论:1.VEGF能够上调MRP1 mRNA及蛋白在肿瘤细胞中的表达。2.VEGF对MRP1启动子活性具有明显的上调作用,这一作用与激活PI3K/Akt信号通路及增强转录因子SP1的表达及活性相关。3.MRP1基因启动子区SP1结合位点突变后其启动子活性减弱,VEGF对其活性的上调作用不如突变之前明显。综上所述,VEGF可通过上调MRP1 mRNA及蛋白的表达促进肿瘤细胞多药耐药的发生,研究VEGF对肿瘤细胞MRP1的调节作用以及调节机制,可以为逆转或预防肿瘤细胞多药耐药提供新的治疗靶点。