论文部分内容阅读
研究背景：近年来，通过胶质细胞来控制神经病理性疼痛已成为一个有前景的研究方向。事实上，从外周到中枢神经系统，胶质细胞表型的改变在整个痛觉传导通路中都有过报道，而且在动物模型中，通过药理学方法抑制这些胶质细胞的活动可以缓解疼痛。胶质细胞和神经元之间复杂的相互作用，依赖于多种机制，包括胶质细胞的类型（星形胶质细胞，小胶质细胞，卫星细胞和雪旺细胞），调节作用的解剖学定位（外周神经，脊髓和大脑）和慢性疼痛的性质。近期的研究表明，在胞内一些特殊的级联反应通路，如MAPK途径和Wnt通路等都是胶质细胞活化参与慢性痛的潜在机制。研究表明小胶质细胞在脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）诱导的神经病理性痛中扮演了重要角色，Toll样受体3（Toll like receptor，TLR3）在神经损伤后的小胶质细胞活化和痛觉过敏的发生中起到了关键的作用。另外，体外实验表明氯胺酮可以抑制小胶质细胞的活化，并且可能通过抑制TLR介导的信号通路降低促炎因子的基因表达。那么氯胺酮是否可以通过抑制小胶质细胞TLR信号通路来治疗神经病理性痛，目前还没有相关报道。此外，星形胶质细胞也在SNL诱导的神经病理性痛中起到了关键作用。星形胶质细胞的活化相比小胶质细胞更晚而更持久，这和神经病理性痛的慢性化特点一致。研究报道海马区的星形胶质细胞Wnt信号通路参与了突触可塑性改变，而在脊髓背角，突触的可塑性改变恰恰是神经病理性痛慢性化的重要机制。那么脊髓背角星形胶质细胞Wnt信号通路是否参与了外周神经损伤所致神经病理性痛脊髓背角的突触可塑性改变，目前仍没有相关报道。研究目的：基于以上研究现状和课题组前期的研究积累，本研究目的在于揭示鞘内注射氯胺酮是否通过抑制TLR3信号通路抑制SNL诱导的小胶质细胞的活化从而发挥抗痛觉过敏作用；此外，探索脊髓背角星形胶质细胞Wnt信号通路是否参与了外周神经损伤所致神经病理性痛的慢性化过程，以及相应调控机制。研究方法：本研究应用行为药理学方法检测药物干预后实验动物痛行为学的改变；应用免疫荧光组织化学方法观察各种细胞以及蛋白活化和其解剖学定位；并进一步通过实时定量PCR和Western blot等方法定量分析相应蛋白分子的表达变化。研究结果：实验一：行为药理学结果表明鞘内给予氯胺酮（30，100，300μg/kg）可以剂量依赖性缓解SNL所致神经病理性痛机械性痛觉过敏。免疫组化荧光染色的结果显示SNL术后3d脊髓背角小胶质细胞明显活化，而鞘内给予氯胺酮（30，100，300μg/kg）可以抑制SNL诱导的小胶质细胞的活化，并存在剂量依赖关系。同时SNL可以诱导脊髓背角p-p38的活化表达，并且其特异性表达在脊髓背角小胶质细胞。Western blot结果显示鞘内注射氯胺酮可以下调SNL诱导的p-p38的表达。另一方面，TLR3激动剂Poly I:C可以诱导机械性痛觉过敏以及脊髓背角的小胶质细胞的活化。而鞘内注射氯胺酮同样可以逆转Poly I:C诱导的机械性痛觉过敏并抑制小胶质细胞的活化。实验二：免疫组织化学荧光染色结果显示，SNL可以诱导脊髓背角星形胶质细胞的活化，并且可以从术后3d持续到21d仍有较高表达。在SNL所致神经病理性痛大鼠模型脊髓中，Wnt-β-catenin信号通路中Wnt-3a主要表达于星形胶质细胞，而Frizzled-4和β-catenin主要表达于神经元。实时定量PCR结果显示，SNL可以诱导脊髓背角Wnt-3a基因在SNL后3天开始表达增高，而且与疼痛的进展有着时间上的相关性，35天时达到高峰，42天时有所下降；而Frizzled-4在术后7d开始高表达，一直持续到28天，35天开始下降；β-catenin同样也在术后7d开始高表达，21天后到达最高值，一直维持到35天，42天时有所下降但依旧在较高水平。Western blot结果显示Wnt-3a分子在术后3d开始表达增高，并且从14d到35d一直都维持在高水平。Frizzled-4在SNL术后3d表达略有升高，这种水平一直维持到35d。β-catenin的表达从14d开始明显上升，直到35天都维持在较高水平。而行为药理学结果显示，SNL术后1d，无论是给予Wnt-3a的中和抗体还是Frizzled-4受体阻断剂干扰Wnt通路都不能缓解SNL所致神经病理性痛，同样星形胶质细胞抑制剂也不能影响SNL所致机械性痛敏。而在术后3d或7d干扰Wnt通路或抑制星形胶质细胞活性，都可缓解SNL所致机械性痛敏。结论：以上结果提示无论是小胶质细胞还是星形胶质细胞都在外周神经损伤所致神经病理性痛中发挥了极其重要的作用。鞘内注射氯胺酮可通过抑制TLR3介导的小胶质细胞p-p38信号通路活化而缓解SNL所致神经病理性痛机械性痛觉过敏。脊髓背角星形胶质细胞Wnt-3a分子及其相应信号通路参与了外周神经损伤所致神经病理性痛慢性化进程，且阻断该信号通路可以治疗神经病理性痛。本研究结论提示将脊髓背角胶质细胞作为研究神经病理性痛靶点将会为临床治疗神经病理性痛提供全新方法和理念。