目的:目前,宫颈癌位居所有癌症死亡率的第四位,女性癌症的第二位[1-12]。随着宫颈癌发病率、死亡率的不断攀升,日益引起人们对宫颈癌的关注。研究表明:宫颈癌的发生与人乳头瘤状病毒(Human papillomavirus,HPV)反复感染有着密不可分的关系[1-12]。因此,早期筛查HPV对于宫颈癌的早发现、早诊断、早治疗起着不可或缺的作用。HPV是一种环形双链DNA病毒[13-30],易侵袭宫颈、皮肤黏膜等鳞柱状上皮组织,通过性传播、间接接触、母婴传播、医源性感染等方式感染[31-35]。由于不同的基因型导致危险度不同,分高中低危三种类型[57]。其中低危型可导致生殖器疣[60-68],高危型会引起宫颈上皮内瘤变[6,20,22,31,36-42],若不及时采取措施则有进展为宫颈癌的风险[40,42-50]。目前,国内外广泛采用的HPV筛查技术很多,最为广泛应用的分子诊断技术是膜杂交法,该方法可以检测出21种基因型,高危型包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV68,中危型为HPV53、HPV66,低危型有HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81。根据检测位点信号的强弱对HPV进行定性分析。其固有缺陷是不能对HPV进行定量,无法在后期临床治疗过程中判断病情变化。随着研究的不断深入,已出现新型HPV检测技术-多重荧光PCR分管技术,与传统方法相比,可检测相同的高危型,更多的中危型,如:HPV26、HPV73、HPV82,及部分低危型,共21种基因型。并能对HPV感染者进行病毒载量定量。本研究通过与目前广泛应用的膜杂交法进行对比,评价多重荧光PCR分管技术的灵敏度、特异性。探讨在HPV筛查方面的作用,以及在病毒载量定量方面对临床治疗中的指导作用。方法:1.选取研究对象:2018.01-2018.10,于中国医科大学附属第一医院妇科门诊就诊,并愿意接受HPV筛查检测的妇女100例,该100例患者以性交出血、阴道不规则流血、白带异常、下腹部坠涨、疼痛等原因为主诉就诊。纳入和排除标准:1)、既往有性生活史,并可接受宫颈粘膜组织活检。2)、非妊娠期及经期,产妇在分娩8周后可以行此项研究。3)、无子宫颈切除史。4)、近期未使用阴道避孕药、阴道润滑剂、阴道抗真菌药等。5)、检测前24小时内无性行为。6)、无肿瘤等消耗性疾病(身体不能力行承受检查过程等特殊情况)。2.HPV基因型的检测:(1)取样:用子宫颈取样器刷取子宫颈鳞柱状上皮交界处脱落细胞,置入无菌管中,密封送检。(2)采用核酸提取仪提取患者子宫颈粘膜上皮细胞的DNA。(3)采用21种靶向基因引物、探针及待测DNA进行加样,并用实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)检测。(4)根据RTQ-PCR图像调节基线起点、终点、阈值,并参考HPV亚型探针荧光标识表,得到筛选的基因型。3.HPV病毒载量的计算:通过TOP3(单拷贝基因,线性关系宫颈脱落细胞数)基础因拷贝数,进而测算样本的细胞数,再经临床样本验证及优化的计算模型,最后可以得出每个亚型在单位细胞(10000)内的病毒载量。结果:1.在100名患者中,有效入选99例。多重荧光PCR分管技术检测阳性样本为22例(22.22%),阴性样本为77例(77.78%)。膜杂交法检测阳性患者为13例(13.13%),阴性样本为86例(86.87%)。两种方法检测有11例结果不一致。2.使用测序技术对两种方法不一致的11例结果进行确认,结果均为阳性。其中多重荧光PCR分管技术有1例基因型结果不一致(一致性为96.3%),定性检测灵敏度为100%,特异性为100%。膜杂交法检测有13例基因型结果不一致(一致性为51.8%),定性检测灵敏度为59.09%,特异性为100%。3.使用多重荧光PCR分管技术检测出膜杂交法漏检的11例样本中,临床追踪9例,其中1例经阴道镜镜检为原位宫颈癌,2例样本经病理学检查为高级宫颈上皮内瘤变。4.多重荧光PCR分管技术与膜杂交法在检测定性结果方面与病毒载量之间有统计学差异(p=0.020)。膜杂交法在漏检基因型方面与病毒载量之间无统计学差异(p>0.05)。5.不同病理学分级与其病毒载量之间有统计学差异(p<0.001)。结论:1.多重荧光PCR分管技术检测灵敏度、特异性都明显优于当前广泛应用的膜杂交法。2.多重荧光PCR分管技术可以对病毒载量进行定量检测,为指导临床治疗提供依据。