背景:　　MicroRNA(miRNA)是真核生物中发现的一种内源性非编码小RNA，通过转录后调控靶基因的表达，对动、植物的生长，发育以及外界环境的胁迫应答都具有非常重要的调控作用。最近，在原核细菌中也有发现长度与miRNA大小相似的小RNA（microRNA-size small RNA，msRNA），同样可以转录后调控mRNA的表达来调节其生理过程。钝顶螺旋藻是一种光合自养的丝状原核蓝细菌，广泛分布在自然界中，在一些极端环境中也能生长，如高盐、寒冷、高低温、紫外辐射、营养缺失、氧化胁迫等，常用作研究抗逆境机理的实验对象。目前，研究者已发现多种钝顶螺旋藻的耐逆境生理机制，但对于钝顶螺旋藻中是否存在非编码的msRNA，以及这些msRNA是否参与了钝顶螺旋藻的抗逆境胁迫机制，至今尚未报道。　　目的:　　本文通过small RNA文库的制备和miRNA高通量测序技术，鉴定钝顶螺旋藻藻株FACHB-350在正常培养条件下和不同浓度的双氧水(50 nM和100 nMH2O2)胁迫下是否存在msRNA，以及这些msRNA的表达丰度在氧化胁迫下是否存在显著性差异。并通过qRT-PCR和核酸杂交技术来验证msRNA的表达及其显著差异性变化，寻找一批与钝顶螺旋藻氧化胁迫相关的msRNA。通过生物信息学预测msRNA的靶基因，并通过qRT-PCR检测msRNA与其靶基因之间是否存在反向变化模式，构建msRNA与其靶基因的作用网络，从而在msRNA水平上来阐释钝顶螺旋藻的抗氧化机制。　　方法:　　1.将培养的螺旋藻株FACHB-350分成三组:对照组(Control)，中浓度氧化胁迫组(MOS)和高浓度氧化胁迫组(HOS)，待生长2周左右，分别用50 nMH2O2和100nMH2O2连续胁迫处理MOS和HOS组钝顶螺旋藻一周，收集藻细胞，并用洗涤缓冲液除去杂菌和杂质。　　2.制备Control，MOS和HOS三组钝顶螺旋藻组织相应的sRNA文库，通过Illumina Solexa系统的miRNA高通量测序得到大量sRNA原始数据，经过数据的挖掘和筛选得到符合标准的msRNA。　　3.以Fold changes≥1.0，p-value≤0.01为条件，筛选双氧水处理下表达丰度有显著差异msRNA。设计msRNA定量PCR的特异性引物，应用SYBR Green定量PCR验证各个msRNA在Control，MOS和HOS三个样品中的表达差异。　　4.使用mirVanaTM miRNA Isolation Kit分别提取Control，MOS和HOS三组钝顶螺旋藻株FACHB-350总RNA。　　5.合成DIG标记的msRNA探针，通过点杂交和Northern blotting技术来进一步验证各个msRNA在Control，MOS和HOS三个样品的表达及其差异程度。　　6.利用Target finder预测各个msRNA的靶基因，并对这些靶基因进行GO功能分析和KEGG代谢通路分析，获得双氧水胁迫下钝顶螺旋藻株FACHB-350内靶基因的调控网络。　　7.qRT-PCR检测Control，MOS和HOS三个样品中部分msRNA靶基因的转录水平，并与对应的msRNA表达变化趋势进行比较，检测是否存在反向变化模式。　　结果:　　1.钝顶螺旋藻株FACHB-350三个样本提取的总RNA和sRNA文库质检合格，可以用于下一步的测序。　　2.高通量测序共获得10，229，325(Control)、9，326，145(MOS)、7，508，874(HOS)条raw reads。经过筛选过滤等步骤，我们共发现有658个msRNA前体序列符合二级结构筛选条件:615个前体序列的5端或3端上只存在一条符合条件的msRNA;43个前体序列上存在两条符合条件的msRNA，分别位于茎环结构的5端和3端，其中有8个前体序列上的两端msRNA能互补配对，且满足3端≤2nt的突起，被认为是潜在的miRNA和miRNA*序列。　　3.通过统计学方法分析正常培养组和氧化胁迫组样本之间msRNA的表达差异，共筛选得到23个msRNA在双氧水胁迫下呈现显著性差异表达。　　4.通过荧光定量PCR和点杂交验证8个msRNA在Control、MOS和HOS的表达，基本上与测序结果相一致。Northern blotting进一步验证了msRNA的表达。　　5.通过Target finder共预测到42个靶基因，对应13个msRNA。GO功能分析发现，这些靶基因主要被归类到cell、cell part、binding、catalytic activity、cellular process和metabolic process条目。GO功能富集分析发现4条在双氧水胁迫和正常培养组间显著性差异富集的GO条目:protein O-linkedglycosylation、 capsule polysaccharide biosynthetic process、 carbohydratemetabolic process和photosynthetic electron transport in photosystemⅡ。　　6.对这些靶基因进行COG功能分类，共被归类到12个功能类别，除了功能未知，主要包括细胞壁的生物合成、无机离子的转运和代谢、碳水化合物的转运和代谢、预测功能和信号转导机制。KEGG代谢途径定位发现10个基因涉及到糖酵解和糖异生、淀粉和蔗糖代谢、D-丙氨酸代谢、光合作用、卟啉和叶绿素代谢、ABC转运蛋白，氨酰-tRNA合成和硝酸盐同化。　　7.靶基因的荧光定量PCR发现，13个选取的靶基因在Control、MOS和HOS中的表达与其对应的msRNA表达丰度变化大部分呈现反向调控模式，进一步证明这些靶基因的表达丰度可能受msRNA的调控，从而参与钝顶螺旋藻内抗氧化胁迫。　　结论:　　运用miRNA高通量测序技术，我们在钝顶螺旋藻株FACHB-350内发现8个潜在的miRNA和23个在双氧水胁迫下存在显著差异性表达的msRNA。运用qRT-PCR和核酸杂交技术进一步验证了这些msRNA的表达，与测序结果相一致。生物信息学共预测到13个msRNA的42个靶基因，对靶基因进行功能分类和代谢途径分析发现这些靶基因大多编码与抗氧化胁迫相关的蛋白或酶。通过qRT-PCR检测到部分靶基因的表达，大多数与msRNA的表达呈现反向变化模式，进一步说明这些靶基因可能受msRNA的转录后负性调控，参与钝顶螺旋藻的抗氧化胁迫。虽然这些钝顶螺旋藻中msRNA的功能显著性仍然需要进一步的确证，但我们的研究表明miRNA不仅局限于真核生物，在原核生物中同样可以通过高通量测序找到一批msRNA，且这些msRNA的功能研究，将更进一步提高我们对蓝藻逆境适应性机制的理解。