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DNA作为遗传信息的载体,其碱基的变异、缺失或者浓度的改变都会导致人类疾病的产生;ATP作为能量的载体,其浓度的紊乱会直接导致心血管病等疾病的产生。因此,DNA和ATP的检测在临床诊断、疾病预防和生物药学等方面具有重要的意义。稀土离子配合物作为一种荧光探针,具有发射谱带窄、化学稳定好、水溶性好、荧光寿命长和生物相容性好等优点,被广泛用于生命分子的检测中。
本论文利用加替沙星-铽配合物荧光体系分别检测了DNA和ATP两种生命物质,并就其发光机理进行了初步的研究和探讨。
本论文共分为以下四部分:
一、简单概述了DNA和ATP的分子结构、检测的意义以及目前的检测方法;较为具体地介绍了稀土离子以及稀土离子配合物作为荧光探针的特点及其在生命分析中的应用。
二、建立了加替沙星-铽(Ⅲ)-小牛胸腺DNA(ctDNA)的荧光新体系并用于ctDNA的测定。ctDNA的加入能够显著地增强加替沙星-铽(Ⅲ)体系的荧光强度,由此建立了加替沙星-铽(Ⅲ)-小牛胸腺DNA(ctDNA)的荧光新体系。在一定的ctDNA浓度范围内,荧光强度的增强△F与ctDNA的浓度呈现良好的线性关系,因此可以实现对ctDNA的定量检测。在最佳条件下,在5.8×10-7gmL-1~2.0×10-5gmL-1的ctDNA浓度范围内,体系的△F值和ctDNA的浓度呈现良好的线性关系,检测限为2.2×10-7gmL-1。本章还对一些干扰物质对体系的影响进行了研究;并对合成水样中的ctDNA进行了检测,回收率在95%~102%之间;此外还对体系发光的机理进行了初步的研究和讨论。该方法无须进行任何标记,检测过程简单快速,重现性良好。
三、建立了加替沙星-铽(Ⅲ)-三磷酸腺苷(ATP)的荧光新体系并用于ATP的测定。ATP的加入能够显著地增强体系的荧光强度。在最佳实验条件下,在2.1×10-6molL-1~2.4×10-5molL-1的ATP浓度范围内,荧光强度的增强△F值和ATP的浓度呈现良好的线性关系,检测限为1.9×10-6molL-1。本章还对一些干扰物质对体系的影响进行了研究。该方法成功用于对ATP注射液的检测,相当于标示量的百分含量在105%~111%之间。此外还利用荧光光谱、紫外吸收光谱等手段初步探讨了体系发光的机理。
四、结合酶催化循环放大和RCA扩增试图建立一种灵敏的均相溶液中的DNA检测方法。在没有目标物DNA时,互补DNA呈现单链状态,其在环状模板,聚合酶,连接酶以及dNTP的存在下进行RCA扩增。加入与RCA扩增产物互补的探针DNA和内插染料SYBRGreen(Ⅰ)后,体系中有较强的荧光信号。而当体系中存在目标DNA的时候,互补DNA与目标DNA杂交形成双链,ExoⅢ将互补DNA催化降解,释放出目标物,目标物继续与互补DNA形成双链,互补DNA再被催化降解,如此循环使互补DNA被持续催化降解,被催化降解的互补DNA不能进行RCA扩增,因此荧光信号较弱。该方法中,每释放一次目标DNA,对应一条被催化降解的互补DNA,而一条互补DNA又能对应一条RCA扩增产物,每条RCA扩增产物内可以插入大量的SYBRGreen(Ⅰ),因此,该方法中,每循环一次可以引起大量的SYBRGreen(Ⅰ)的荧光信号改变;该方法不需要对DNA进行荧光标记;整个反应过程和检测过程在均相溶液中进行,不需要固定和分离。我们对该实验进行了初步的研究,并优化了ExoⅢ的灭活时间和引物的浓度。