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目的本课题使用CRISPR/Cas9技术靶向抑制小鼠ADAM9基因的表达,研究小鼠急性酒精性肝损伤过程中ADAM9基因的功能及其调控的分子机制。方法(1)在NCBI中搜索ADAM9相关的基因序列,并找出人鼠共有的ADAM9基因序列的外显子和内含子,在外显子中查找人鼠相同CRISPR序列设计位点处的基因序列,构建三个同时表达sgRNA、Puromycin和Cas9的三合一质粒。(2)将3个质粒以1:1:1的比例,加入小鼠成肌细胞培养皿中,并加入细胞转染剂,对细胞进行转染;继续培养转染细胞,待细胞浓度达到70%左右时,更换含有嘌呤霉素抗性的筛选培养基筛选耐药阳性细胞;待形成稳定的阳性克隆后,提取细胞DNA,进行测序比对,找出使细胞DNA产生突变的质粒。(3)购买健康清洁级昆明雄性小鼠36只,用普通饲料喂养一周待小鼠适应环境后,随机平均分为3组:正常组(Normal)12只,注射生理盐水酒精灌胃组(saline+alcohol)12只,注射质粒酒精灌胃组(ADAM9-sgRNA3+alcohol)12只。对照组小鼠不做任何处理,sgRNA组小鼠分别注入筛选出的活性质粒,模型组小鼠尾静脉注射等量生理盐水;将尾静脉注射后的小鼠常规喂养3天,在第3天末,将小鼠分别采用一次经口灌胃56度红星二锅头(24mL/kg)后禁食24h来诱导小鼠急性肝损伤模型。在24h末,采用眼球采血方法对所有试验小鼠进行取血,血液凝固后离心分离血清检测AST、ALT变化,眼球采血后迅速椎脱臼处死小鼠分离提取肝脏。石蜡切片苏木精-伊红染色(HE染色)检测各组小鼠肝组织的损伤情况;过碘酸雪夫染色检测各组小鼠肝脏糖原变化情况;Hoechst33258细胞凋亡染色检测各组间肝细胞的增值凋亡变化情况;免疫印迹方法检测以下蛋白变化情况:解整合素-金属蛋白酶9(a disintegrin and metalloproteases 9),应激因子(heat shock protein27,HSP27)、(heat shock protein70,HSP70),增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Bcl-2(Bcl-2),半胱蛋白酶-3(Caspase cystenyl-aspartate-specific protease,Caspase-3),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),磷酸化的信号转录因子-3(phosphorylation of signal transcription factors-3,p-STAT-3)。结果共构建出三个质粒,经细胞试验筛选后鉴定sgRNA3为活性质粒,酒精灌胃小鼠肝损伤情况:1.血清转氨酶变化情况:ADAM9-sgRNA3+alcohol组小鼠血液中转氨酶活性显著低于saline+alcohol组(P<0.01),两组均高于Normal组(P<0.01或P<0.05)。2.苏木精-伊红染色情况:ADAM9-sgRNA3+alcohol组小鼠肝细胞坏死程度显著低于saline+alcohol组小鼠(P<0.01),两组均高于Normal组(P<0.01或P<0.05)。3.过碘酸雪夫试剂染色结果:ADAM9-sgRNA3+alcohol组小鼠肝脏糖原的含量高于saline+alcohol组小鼠(P<0.05),两组均低于Normal组(P<0.01或P<0.05)。4.Hoechst33528染色情况:ADAM9-sgRNA3+alcohol组小鼠比ADAM9-sgRNA3+alcohol组小鼠肝细胞凋亡的数目少(P<0.05),两组均高于Normal组(P<0.01或P<0.05)。5.蛋白印迹结果:与saline+alcohol组小鼠相比较,ADAM9-sgRNA3+alcohol组小鼠肝细胞内HSP27,HSP70,PCNA,VEGF,Bcl-2和p-STAT3的蛋白表达量显著增高(P<0.05或P<0.01),而Bax,Caspase-3,ADAM9的蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论ADAM9在小鼠急性酒精性肝损伤过程中通过调节细胞增殖、凋亡和应激代谢等相关基因表达起到促进肝损伤的作用。利用CRISPR/Cas9技术靶向抑制小鼠ADAM9基因的表达可以减轻酒精诱导的小鼠急性肝损伤。