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前言HER2/neu是与人类肿瘤发生、发展密切相关的重要原癌基因,在乳腺癌中过表达率达30%左右,且与不良的预后和治疗的抗性有关。研究表明联合应用人源化的抗HER2/neu单克隆抗体Herceptin能够有效提高化疗和放疗的敏感性,延长病人的生存期。但是研究显示Herceptin的作用机理复杂,即使是对HER2/neu过表达的患者使用Herceptin治疗,其有效率也只有15-20%,提示有其他因素决定治疗的有效性和敏感性。肿瘤抑制基因p53的产物可以诱导细胞周期G1-S期的阻滞或引起凋亡。约60-70%的人类肿瘤的发生与p53基因突变而导致的其蛋白产物功能性丢失密切相关。但是,在某些肿瘤中,虽然p53为野生型,但却失去了正常的p53功能,提示有其它因素抑制了野生型p53活性及功能的发挥。作为受体型蛋白酪氨酸激酶,HER2/neu过表达时能够在没有细胞外配体的情况下自身激活PI3K-AKT通路,而PI3K通路的激活与p53介导的凋亡受阻有关。另有研究表明抗HER2/neu单克隆抗体能够下调PI3K-AKT通路,提升乳腺癌细胞内p53蛋白的含量,提高放疗和化疗的敏感性。以上均提示HER2/neu过表达可能通过PI3K-AKT通路作用于p53基因,从而影响乳腺癌细胞的增殖和凋亡,但迄今为止,尚未见相关的直接证据。Ras 基因转染或突变的细胞能够对DNA损伤引起的p53依赖性凋亡产生抗性。HER2/neu作为表皮生长因子受体家族的一员,在过表达的情况下能够激活Ras/Raf/MEK/MAPK通路,但是否通过此通路对乳腺癌细胞内p53表达产生影响,进而影响细胞的增殖和凋亡,目前亦未见报道。本课题从细胞和人体组织水平研究了乳腺癌中HER2/neu过表达对野生型p53蛋白含量的影响及其发生的相关信号通路;并进一步探讨了上述这种改变对乳腺癌细胞的增殖和放、化疗敏感性的影响,分析了HER2/neu过表达的患者对治疗产生抗性的可能机理,为乳腺癌的治疗提供了新的理论和实验依据。第一部分 抗HER2/neu单克隆抗体的制备及其对乳腺癌细胞生长的抑制性目的:制备抗HER2/neu单克隆抗体并筛选出能够抑制HER2/neu过表达乳腺癌<WP=6>细胞生长的克隆。方法:利用原核系统表达含全长HER2/neu蛋白的融合蛋白,免疫Balb/c雌性小鼠,取效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。采用有限稀释法进行亚克隆;ELISA筛选;免疫组织化学、免疫细胞荧光法进行抗体鉴定;噻唑蓝(MTT)比色法筛选能够抑制HER2/neu过表达乳腺癌细胞生长的克隆。结果:成功表达及纯化出全长HER2/neu蛋白,一次融合共获得8株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体在用于乳腺癌免疫组织化学检测中与商品化的抗体效果相当,且其中5株细胞产生的抗体体外实验能够抑制HER2/neu过表达的乳腺癌细胞HBT133的生长。结论:成功表达和纯化含全长HER2/neu蛋白的融合蛋白;成功制备抗HER2/neu单克隆抗体;自制的8株单抗能够用于免疫组织化学检测;能够抑制HBT133细胞生长的5株杂交瘤细胞株可以用作人源化,具有较高的应用价值。第二部分 HER2/neu过表达对乳腺癌细胞p53,p21和mdm2蛋白的影响目的:检测HER2/neu过表达对乳腺癌细胞MCF7中p53和p21蛋白含量的影响。探讨HER2/neu过表达对MCF7细胞p53蛋白含量影响的可能机制。方法:脂质体介导的稳定转染方法建立HER2/neu过表达的MCF7细胞;采用Western blot检测HER2/neu过表达对MCF7细胞p53,p21蛋白含量的影响,半定量RT-PCR检测p53 mRNA水平;Western blot和间接细胞免疫荧光检测HER2/neu过表达对mdm2表达和定位的影响。结果:获得高表达HER2/neu的MCF7细胞克隆(MCF7-neu3); MCF7-neu3细胞p53蛋白含量低于对照组(未转染MCF7细胞),p21蛋白含量升高,但经半定量RT-PCR结果显示p53 mRNA 水平无明显改变;Western blot 结果显示:与MCF7细胞相比,MCF7-neu3细胞中mdm2总蛋白水平无明显改变,但核蛋白中mdm2含量增高。细胞免疫荧光结果显示,MCF7-neu3中mdm2蛋白更多定位于细胞核中,而MCF7中mdm2蛋白更多定位于细胞质中。结论: HER2/neu过表达能导致MCF7细胞中mdm2向细胞核内转位,野生型p53蛋白含量减少,p21蛋白含量升高。第三部分 HER2/neu过表达经PI3K和Ras/Raf/MEK/MAPK通路下调乳腺癌细胞野生型p53蛋白含量目的:探讨HER2/neu过表达对p53蛋白含量的影响及其与PI3K和<WP=7>Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路的关系。方法:Western blot检测转染HER2/neu对MCF7细胞中信号转导分子Akt,P-Akt,p-MAPK,p-Raf,p-MEK蛋白含量的影响;采用PI3K信号通路抑制剂LY294002和MEK抑制剂U0126处理,观察其对MCF7-neu3和MDA-MB-453细胞p53蛋白含量的影响。结果:与MCF7细胞相比,MCF7-neu3细胞中p-Akt,p-MAPK,p-MEK,p-Raf蛋白含量升高;经PI3K通路抑制剂LY294002及MEK抑制剂U0126处理后,MCF7-neu3细胞内野生型p53蛋白含量明显上升,MDA-MB-453细胞中突变型p53蛋白含量无明显改变。结论: HER2/neu过表达经PI3K和Ras/Raf/MEK/MAPK通路下调乳腺癌细胞中野生型p53蛋白含量,而对突变型p53蛋白含量无明显影响。第四部分 HER2/neu过表达经PI3K通路对乳腺癌细胞生长和放、化疗敏感性的影响目的:探讨HER2/neu过表达经PI3K通路对乳腺癌细胞生长和放、化疗敏感性的影响及其可能机制;方法:MTT检测细胞增殖及阿