马铃薯晚疫病菌有性生殖后代群体结构比较分析

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由致病疫霉(Phytophthora infestans,P.infestans)引起的晚疫病(Potato late blight,PLB)是世界范围内马铃薯的毁灭性病害之一。本研究采集并分离、纯化来自于云南省昆明市马铃薯主产区的PLB病样,利用形态学和ITS序列定种后,确定其染色体倍性、交配型、线粒体单倍型、毒性和甲霜灵敏感性。选取其中5株菌株,利用改良的卵孢子萌发方法得到有性生殖F1代群体;然后对F1代群体的表型(交配型、致病性、甲霜灵敏感性)和基因型(染色体倍性、线粒体单倍型、SSR标记)进行测定并用相关性分析解析基因型和表型之间的联系。在得到上述结果的基础上,利用1对P.infestans亲本诱导有性生殖得到的F1代交配型分离群体(A1、A2、A1A2、自育型)进行全基因组重测序和比较分析。本研究的主要结果有:1.2017年7月中旬,在云南省昆明市寻甸县和嵩明县不同马铃薯品种上采集晚疫病发病叶片,分离纯化和鉴定得到共19株P.infestans。对峙培养后鉴定出A1交配型3株,A2交配型12株,A1A2交配型1株,自育型3株。对19株P.infestans线粒体DNA单倍型进行测定,发现19株P.infestans线粒体DNA单倍型均为Ⅰa型,为云南省的优势群体。2.实验采用低温诱导卵孢子萌发的实验方法,利用6对亲本组合,得到冷冻处理24 h为最佳条件,卵孢子的平均萌发率达5.80%±0.20%。在萌发的F1代群体中,所有菌株染色体都为二倍体,所有线粒体单倍型都没有发生重组,均和亲本一致。结果还发现,F1代的交配型、甲霜灵敏感性和毒性都发生了分离,其中交配型分离比为A1:A2:A1A2:自育=16:5:17:22,对甲霜灵的敏感性分离比为抗:感=1:14,毒性分离比为抗:感=5:19,三个表型的分离均明显偏离孟德尔单基因显性遗传特点。利用8对SSR多态性引物对有性生殖F1代群体的基因型分析表明,在遗传相似系数为0.98时,可将所有菌株分为14个基因型;在遗传相似系数为0.95时,可将有性生殖F1代群体分为6个分支,其中优势群体为S1,占分离群体的61.67%;相关性分析进一步表明,8对SSR所代表的基因型和几个重要表型有较好相关性(R2=0.6667)。3.利用Illumina PE150二代测序技术对4种交配型的分离群体(BSA1、BSA2、BSA3和BSA4)做全基因组10X重测序,利用CLC genomic workbench 11.0.1,以NCBI中A1交配型菌株T30-4为参考基因组进行拼接、注释及混合分组法分析,结果发现在4个BSA分离群体中总共存在528712个SNP;InDels数量最多的是BSA4,为20849,最少的是BSA2,为17746;SV数量最多的是BSA4,为6613,最少的是BSA2,为5097;两两比较发现,BSA1和BSA2之间的SNP数量最多,达到了38551个,最少的为BSA2和BSA4,仅有19630个。综上所述,本研究结果表明2017年在云南省昆明市寻甸县和嵩明县采集的19株马铃薯晚疫病菌中4种(A1、A2、A1A2、自育型)交配型都有,但A1交配型的菌株相对其他交配型的较少,并且这19株菌株的线粒体DNA单倍型都为Ⅰa型;采用低温处理的方法诱导卵孢子的萌发,通过对有性生殖F1代群体的表型和基因型的研究分析,解析了有性生殖的遗传规律;还通过对有性生殖F1代的4个和交配型连锁的分离群体进行全基因组重测序、组装,进一步可以利用比较基因组法解析控制交配型这一重要性状的功能基因或紧密连锁的相关决定位点。
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