次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT,E.C.2.4.2.8)是嘌呤核苷酸合成补救途径中的一个关健酶，催化次黄嘌呤/鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成黄嘌呤/鸟嘌呤单核苷酸。由于绝大多数寄生虫缺乏与哺乳动物相对应的嘌呤核苷酸从头合成途径，而只能依靠补救途径，从而使HGPRT成为治疗寄生虫病的一个靶点。此外，人类HGPRT由于突变造成的功能缺失，会引起痛风和Lesch-Nyhan综合症。我们此项研究的目的是基于HGPRT的结构进行突变，使其能接受嘌呤或PRPP的类似物作为底物，合成嘌呤核苷酸的类似物。这些核苷酸类似物可作为先导化合物进行抗肿瘤抗病毒药物的筛选。 成功克隆并表达了来源于泉生热孢菌(Thermoanaerobactertengcongensis)的HGPRT基因，对它进行了鉴定及酶动力学分析。结果表明HGPRT在溶液中以四聚体的形式存在，最适底物是次黄嘌呤，最适反应条件为pH8.0/70℃，在50℃的半衰期为75分钟，在4℃保存3个月活性未见下降。提纯的蛋白进行了晶体生长试验，得到了HGPRT，HGPRT-IMP复合物，以及一个HGPRT突变体L160I的蛋白晶体，并分别收集到了2.5，2.2，1.7(A)的衍射数据。目前，这三套数据的结构解析及精修已经完成，并提交PDB数据库(PDBID:1R3U，1YFZ，2GEB)。活性中心的镁离子结合方式暗示二价阳离子的结合可能是底物结合的前提条件。产物IMP的结合方式与以往报道不同，这可能与此酶较严格的产物反馈抑制有关。泉生热孢菌HGPRT作为第一个被研究的嗜热生物的嘌呤磷酸核糖转移酶，为我们研究这一蛋白家族热稳定性的来源提供了结构基础，并且为设计更加热稳定性的蛋白提供了参考。通过结构的比较发现了一些独特的结构特征，包括活性中心有着独特结构的flexibleloop，更高含量的带电荷氨基酸残基和盐桥，更紧密的四聚体结合方式，结合嘌呤底物的三残基芳香族残基簇等等。 我们通过点突变的方法得到11个单突变体和3个双突变体，动力学分析表明，部分突变体对某些嘌呤类似物表现出活性。突变体L160I的结构中，酶活性中心意外发现结合了一段肽链，暗示了一种新的酶抑制剂设计策略的可行性，可能会解决目前抑制剂选择特异性不高的难题。 枯草杆菌可以通过从头合成以及补救途径合成嘌呤核苷酸，但有实验证据表明枯草杆菌hgprt是一个不可缺的基因，提示我们枯草杆菌hgprt可能有另外的功能。我们确定了枯草杆菌HGPRT及其四种复合物结构，尝试从结构的角度探讨这个基因如此重要的原因。 几个晶体结构中都出现了融合tag部分帮助晶体形成的现象，由此提出一种新结晶方法的设想。 本论文包括的其他工作有：高通量结构基因组学技术平台的建立，几个蛋白的晶体学研究(人类尿苷磷酸化酶，未知功能的人类分泌蛋白H84，促进细胞凋亡的人类蛋白CARP，人类DNA片断化因子45的一个片断，人类食管癌相关蛋白Clorf1O，乙型肝炎病毒表面抗原preS)，三个蛋白结构的精修(未知功能的人类蛋白H23，两个枯草杆菌TetR转录因子家族成员BS67和BS72)。