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本文运用细胞培养、[Ca2+]i荧光染色、细胞凋亡DAPI染色、Western bloting等细胞学分子生物学技术,综合研究了鱼藤酮诱发神经细胞凋亡过程中,胞内游离钙离子([Ca2+]i)变化及其对mTOR信号通路的影响。探讨了[Ca2+]i在鱼藤酮致神经细胞凋亡中的调控作用及[Ca2+]i升高机制,以及通过CaM抑制剂TFP论证了CaM在鱼藤酮上调胞内[Ca2+]i信号引发神经细胞凋亡过程中信号转导分子机制。具体结果如下：1鱼藤酮诱导神经细胞[Ca2+]i升高涉及mTOR通路抑制和凋亡以PC12和原代神经元为对象,采用不同鱼藤酮浓度(0、0.05、0.1、0.3、0.5、1μM)处理24h、或用胞内钙螯合剂BAPTA/AM预处理1h,然后暴露0.5和1μM鱼藤酮4或24h,以Fluo-3/AM为荧光探针分析细胞内钙离子([Ca2+]i)的荧光强度,One Solution分析细胞活性,DAPI染色分析细胞凋亡,并用Western blot分析BAPTA/AM对鱼藤酮诱导神经细胞凋亡过程中mTOR信号通路影响。结果显示,鱼藤酮以浓度依赖的方式触发[Ca2+]i升高导致神经细胞凋亡,并关联着mTOR及其介导的S6K1和4E-BP1通路抑制。BAPTA/AM可以通过阻滞mTOR通路抑制,且明显削弱鱼藤酮诱导的PC12细胞和原代神经元凋亡。提示：鱼藤酮诱导神经细胞[Ca2+]i升高涉及mTOR通路抑制和凋亡。2鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高机理及与抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡关系选用内质网IP3受体抑制剂2-APB和钙离子螯合剂EGTA来研究内质网内钙和胞外钙是否参与了鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高。PC12细胞和原代神经元接种于6孔或96孔培养板中,在2-APB (100μM)或EGTA (100μM)预处理1h后,暴露0.5和1μM鱼藤酮处理4或24h。分别采用One Solution分析细胞活性,以Fluo-3/AM为荧光探针分析2-APB或EGTA对[Ca2+]i的影响并结合DAPI染色观察其对鱼藤酮诱发的神经细胞凋亡的保护作用；同时利用Western Blotting检测2-APB或EGTA阻断胞内钙库释放或胞外钙来源后,对神经细胞凋亡过程mTOR信号通路的影响。结果显示,2-APB或EGTA可以明显降低鱼藤酮诱发的[Ca2+]i水平,通过逆转mTOR、S6K1和4E-BP1磷酸化抑制,能够削弱鱼藤酮诱导的PC12细胞和原代神经元活性下降和凋亡。提示：内质网上IP3R激活,钙释放通道的打开,以及胞外钙离子的进入可能是鱼藤酮引发[Ca2+]i升高的重要机制,2-APB或EGTA对神经细胞死亡有明显保护作用。3鱼藤酮通过[Ca2+]i升高介导CaM活化抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡PC12细胞和原代神经元接种于6孔或96孔培养板中,在TFP (10μM)、 BAPTA/AM (30μM)、2-APB (100μM)或EGTA (100μM)预处理1h后,暴露0.5和1μM鱼藤酮处理4或24h。分别采用One Solution分析细胞活性,DAPI染色分析细胞凋亡、Western Blotting检测TFP对神经细胞mTOR信号通路以及BAPTA/AM、2-APB、EGTA或TFP对caspase-3和PARP表达的影响。结果显示,TFP可以明显逆转鱼藤酮诱发的mTOR, S6K1和4E-BP1磷酸化抑制、削弱鱼藤酮诱导的PC12细胞和原代神经元活性下降和凋亡。鱼藤酮升高[Ca2+]i介导caspase依赖地神经细胞凋亡,BAPTA/AM、EGTA、2-APB或TFP阻止鱼藤酮诱导原代神经元caspase通路激活。提示：鱼藤酮通过[Ca2+]i升高介导CaM活化抑制mTOR通路涉及神经细胞凋亡。