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目前甲基化基因与黑暗链霉菌的基因组合,获得功能表达的研究未见报道。如果将甲基化基因导入到黑暗链霉菌的适当位点,实现表达,则有望产生新的化合物。基于黑暗链霉菌Tt49具有生长快、产抗能力强、孢子多和遗传背景相对了解等优点,因此选择它作为模式菌来研究基因异源表达。Tt49可以产生妥布霉素、氨甲酰妥布霉素和安普霉素等复合物,次级代谢产物组分较多。而敲除tobM2基因后主产安普霉素和尼泊拉胺,组分相对简单,因而将外源基因导入到tobM2位点是个理性的选择。构建含有tobM2两边的同源序列和甲基化基因的载体,通过接合转移技术将重组载体导入到Tt49中,将甲基化基因整合到特定位点,探讨甲基化基因异源表达的可能性。本研究选取来自红色链霉菌的甲基化基因eryBⅢ,eryCⅥ,ery 和来自金色链霉菌的甲基化基因ctcK作为研究对象,具体内容如下:1.探索基因异源表达的可能性。genP和forP都具有C3’,C4’-双脱羟基功能。以小单孢菌作为出发菌株,通过基因重组原理构建forP替换genP的工程菌TP322。TP322代谢产物经TLC和MS分析,结果是该工程菌仍然产生庆大霉素C1组分,这说明了forP基因实现了异源表达。2.eryBⅢ基因替换tobM2工程菌的构建。构建eryBⅢ基因替换tobM2的同源重组质粒pBM6,经接合转移导入黑暗链霉菌Tt49,最终得到工程菌TB322。对TB322的发酵产物进行TLC和MS检测,结果不再产妥布霉素和氨甲酰妥布霉素,主产安普霉素和尼泊拉胺,并没有得到预期的甲基化产物。3.EryCVI蛋白的表达与工程菌TC322的构建。表达载体经诱导成功的表达出来EryCVI蛋白。应用与工程菌TB322—样的构建方法,得到eryCⅥ基因替换tobM2的工程菌TC322,发酵产物经TLC和MS检测,发现其与菌株TB322结果类似,基因的替换只是相当于敲除了tobM2 甲基化基因的功能并没有体现出来。4.EryG蛋白的表达与工程菌TG322的构建。表达载体经诱导成功的表达出来EryG蛋白。应用同源重组原理构建eryG替换tobM2工程菌,对其次级代谢产物MS分析,结果与工程菌TC322类似。对单交换工程菌经TLC分析表明甲基化基因没有起作用。5.工程菌TK322与TKQ322的构建。应用基因工程手段构建ctcK(金霉素C-6甲基化基因)替换tobM2工程菌,对其发酵产物进行TLC和MS分析,其结果没有发现甲基化基因的表达。考虑到可能是甲基化基因表达量太少的原因,在甲基化基因前插入红霉素启动子,获得另一株工程菌TKQ322,经质谱分析也未发现次级代谢产物被甲基化修饰。