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食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，每年全世界因为食管癌死亡的人数大约有30万人。食管癌的发病率和死亡率每一个国家都相差悬殊。中国是世界上食管癌的高发区，男性多于女性，年龄40岁以上多见，每年约有15万人死于食管癌。多基因参与、多因素作用、多阶段共同作用参与了食管癌的发生和发展过程，但是其确切的发病机制目前尚不明确。大量研究成果已经表明：食管癌的起源方式往往从多个相邻的癌变小灶起源，即多中心性起源。食管癌早期不易察觉，就诊的患者大多数都是中晚期，预后欠佳。因此，目标信号转导通路和新的抗肿瘤药物的研发对食管癌的发生是至关重要的，仍然是临床工作的主要目标。研究表明，mTOR/P70S6K信号通路在多种肿瘤（包括食管癌）的发生和发展过程中存在过度激活。mTOR/P70S6K信号通路通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进肿瘤新生血管、促进侵袭和转移介导肿瘤的发生发展。P70S6K是此通路下游的关键蛋白，它是mTOR直接作用的底物，mTOR可以使其磷酸化为p-P70S6K，而cIAP1是凋亡抑制因子，caspase-3是凋亡蛋白酶caspase家族的重要成员，它们在食管癌的发生发展过程中均发挥重要作用。本实验通过给裸鼠接种ECA109食管鳞状细胞癌细胞株，建立裸鼠食管鳞癌原位移植瘤模型，给予低、中、高剂量Bufalin（0.5mg/kg，1.0mg/kg，1.5mg/kg）、雷帕霉素（rapamycin）及二者联合应用，完整剥除瘤体，通过RT-PCR法检测P70S6K、cIAP1及caspase-3mRNA表达水平，westernblot方法和免疫组织化学方法检测P70S6K、cIAP1、活性caspase-3蛋白表达水平及P70S6K活化水平，进一步了解Bufalin抑制P70S6K介导食管癌的发生机制及Bufalin对肿瘤细胞凋亡的作用，为临床治疗食管癌提供可靠的理论依据。目的：探讨Bufalin对裸鼠食管鳞状细胞癌原位移植瘤中P70S6K、cIAP1及caspase-3表达的影响。方法：1将处于对数生长期的ECA109细胞用0.25%胰酶消化，调整成终浓度为1.0×107/ml，用1ml注射器注射到裸鼠右侧腋部皮下，每只0.2ml，共接种36只，饲养约15d（此时裸鼠肿瘤大小达到1cm3左右），将建立好的裸鼠食管鳞状细胞癌原位移植瘤模型随机分为6组，每组6只，即模型组（生理盐水组）、Bufalin低剂量组（0.5mg/kg，BL）、Bufalin中剂量组（1mg/kg，BM）、Bufalin高剂量组（1.5mg/kg，BH）、雷帕霉素组（RAPA）、Bufalin与雷帕霉素联合应用组（BR），腹腔注射给药30天，模型组每只注射0.2ml，雷帕霉素组每只注射50μg/kg，每天一次，联合用药组隔天注射一次。用药期间记录裸鼠饮食和精神状态变化，测量裸鼠体重和肿瘤大小，用药结束后处死全部裸鼠，完整剥除瘤体，测量肿瘤大小、计算肿瘤抑制率、HE染色观察肿瘤细胞形态学变化。2TUNEL标记法检测裸鼠移植瘤细胞的凋亡指数。3RT-PCR法检测裸鼠移植瘤中P70S6K、cIAP1及caspase-3mRNA的表达。4Western blot方法及免疫组织化学方法检测裸鼠移植瘤中P70S6K、cIAP1、活性caspase-3蛋白表达水平及P70S6K活化水平。结果：136只裸鼠均成瘤，成瘤率为100%。用药期间各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）裸鼠饮食及精神状态未见明显异常；用药前各组裸鼠体重差异无统计学意义（20.9±2.4g，20.8±1.5g，20.8±2.1g，20.9±2.7g，20.9±1.9g，20.8±2.1g，P>0.05），用药结束后第一天测量各组裸鼠体重，差异无统计学意义（27.9±3.0g，28.2±1.9g，27.9±2.9g，28.1±2.8g，27.9±2.0g，27.8±2.6g，P>0.05）。2治疗期间各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）裸鼠肿瘤体积仍在增大，肿瘤大小分别1.778±0.176cm3，1.714±0.188cm3，1.115±0.124cm3，0.713±0.122cm3，0.699±0.079cm3，0.506±0.076cm3，各用药组肿瘤抑制率分别为4.1%，37.6%，60.1%，60.9%，71.7%，除模型组和BL组（P>0.05）、BH组和RAPA组（P>0.05）外，差异均有统计学意义（P<0.05）。3各组裸鼠原位移植瘤形态学观察结果：显微镜下观察HE染色切片，裸鼠原位移植瘤的瘤组织呈低分化鳞状细胞癌，癌细胞异形性明显，核大深染，细胞形态多样，排列成大小不等的实性巢，核染色质呈粗颗粒状，核仁明显，少见细胞间桥及角化。模型组瘤组织无坏死或偶见点状坏死，BL组瘤组织可见点状坏死，BM组瘤组织以灶状坏死为主，BH组、RAPA组、BR组瘤组织可见大片状坏死灶。4TUNEL标记法显示：凋亡细胞核呈棕黄色。各用药组（BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）凋亡指数分别为13.67%，16.17%，10.83%，10.33%，8.5%，明显高于模型组（2.17%），以BM组凋亡指数最高；BR组与RAPA组、BH组相比差异有统计学意义（P<0.05）。5RT-PCR结果显示：（1）各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）cIAP1mRNA的相对表达量为0.929±0.044，0.889±0.048，0.664±0.044，0.503±0.046，0.496±0.045，0.357±0.038，mRNA表达逐渐减低，除模型组和BL组（P>0.05）、BH组和RAPA组（P>0.05）外，差异均有统计学意义（P<0.05）；（2）各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）caspase-3mRNA的相对表达量为0.342±0.079，0.370±0.040，0.679±0.027，0.768±0.046，0.778±0.045，1.010±0.079，mRNA表达逐渐升高，除模型组和BL组（P>0.05）、BH组和RAPA组（P>0.05）外，差异均有统计学意义（P<0.05）；（3）各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）P70S6K mRNA表达无明显变化（0.831±0.070，0.858±0.043，0.859±0.050，0.841±0.043，0.835±0.048，0.871±0.026，P>0.05）。6Western blot结果显示：（1）各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）P70S6K磷酸化水平的相对表达量为1.203±0.057，1.153±0.061，0.852±0.072，0.611±0.037，0.559±0.056，0.400±0.017，cIAP1的相对表达量为1.222±0.025，1.172±0.065，0.769±0.054，0.552±0.050，0.545±0.046，0.342±0.030，蛋白表达逐渐减低，除模型组和BL组（P>0.05）、BH组和RAPA组（P>0.05）外，差异均有统计学意义（P<0.05）；（2）模型组未检测到活化状态的caspase-3，各用药组（BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）活性caspase-3的相对表达量为0.561±0.045，0.760±0.043，0.873±0.044，0.880±0.039，1.115±0.065，除BH组和RAPA组（P>0.05）外，差异均有统计学意义（P<0.05）；（3）各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）P70S6K蛋白表达均无明显变化（0.788±0.020，0.790±0.014，0.787±0.015，0.790±0.020，0.791±0.016，0.785±0.020，P>0.05）。7免疫组织化学结果：（1）各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）p-P70S6K免疫反应积分为11.00±1.55，9.67±1.86，6.67±1.03，3.5±0.55，3.33±0.52，2.17±0.41，cIAP1免疫反应积分为11.50±1.22，10.00±2.19，7.00±1.10，3.83±0.41，3.67±0.52，2.67±0.52，蛋白表达逐渐降低，除模型组和BL组（P>0.05）、BH组和RAPA组（P>0.05）外，差异均有统计学意义（P<0.05）；（2）模型组活性caspase-3的免疫反应积分为0，各用药组（BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）活性caspase-3免疫反应积分为3.50±0.55，7.00±1.10，8.50±0.55，8.67±0.52，10.83±1.83，蛋白表达逐渐升高，除BH组和RAPA组（P>0.05）外，差异均有统计学意义（P<0.05）；（3）各组（模型组、BL组、BM组、BH组、RAPA组、BR组）P70S6K免疫反应积分为8.33±0.52，7.83±1.47，8.5±0.55，8.17±0.41，8.67±1.97，8.83±1.6，蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1Bufalin对裸鼠食管鳞状细胞癌原位移植瘤具有显著的抑制作用。2Bufalin可以下调P70S6K的磷酸化水平，而P70S6K则不受影响，提示Bufalin可能是通过抑制P70S6K活化而发挥作用的，从而抑制裸鼠移植瘤的生长。3Bufalin能够抑制凋亡抑制因子cIAP1的表达，同时上调活性caspase-3，提示诱导肿瘤细胞凋亡可能是其抗肿瘤的重要机制之一。