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研究目的转录因子c-Maf作为大Maf家族中重要的一员在多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)的发生发展中起重要作用。我们课题组的前期研究发现c-Maf可以通过泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)发生降解,并且发现泛素连接酶HERC4能够与c-Maf结合并介导其发生多聚泛素化和蛋白酶体降解。由于c-Maf的功能极其重要,我们推测可能还存在其他调控c-Maf稳定性的蛋白质。本研究旨在发现参与c-Maf泛素化降解的相关蛋白,并阐明其作用机理,为MM的靶向治疗提供参考。研究方法1、在HEK293T细胞中共转c-Maf质粒与E3相关质粒,利用Western blot检测c-Maf的蛋白表达水平,筛选出可下调c-Maf蛋白水平的E3相关蛋白TMEPAI。2、细胞在放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理后用Western blot检测蛋白质半衰期以便进一步验证TMEPAI对c-Maf蛋白稳定性及半衰期的影响。3、利用免疫沉淀技术研究TMEPAI对c-Maf蛋白泛素化水平的影响。4、构建TMEPAI的点突变体及各功能域缺失突变体,利用Western blot和免疫沉淀技术检测TMEPAI的各突变体对c-Maf泛素化水平的影响。5、构建c-Maf特异性识别元件的荧光素酶报告基因质粒(pGL4-MARE-Luci),在与TMEPAI共转染后分析TMEPAI对c-Maf转录活性的影响。6、利用慢病毒包装技术,研究TMEPAI对内源性c-Maf的表达及对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响。研究结果1、将c-Maf与不同的E3或E3相关蛋白质共处理24小时,分析细胞中c-Maf的蛋白质水平,发现TMEPAI能明显地下调c-Maf的蛋白表达水平,并且c-Maf的这种降解表现为对TMEPAI的时间和浓度依赖性。在用CHX抑制了蛋白质的重新合成后,TMEPAI显著性缩短了c-Maf蛋白的半衰期。2、MafA和MafB与c-Maf同属大Maf家族,蛋白质结构有很高的相似性,但是TMEPAI对MafA和MafB的蛋白稳定性和半衰期没有明显作用,说明TMEPAI对c-Maf的作用具有一定的特异性。3、免疫沉淀实验发现TMEPAI与c-Maf不存在相互作用。已知TMEPAI能够通过与HECT型E3(NEDD4)的WW结合而介导蛋白质的降解,为此我们将TMEPAI与NEDD4共转后发现c-Maf的泛素化水平增高并且降解速度增快。但是另一个含有WW的E3连接酶WWP2则不能增强TMEPAI对c-Maf泛素化和稳定性的调节作用,提示NEDD4在TMEPAI活性中的作用性。4、通过构建不同的TMEPAI突变体,发现TMEPAI的膜域(TM domain)和PY模序(PY motif)在c-Maf的泛素化降解过程中发挥了重要作用。TM域缺失后TMEPAI不能介导c-Maf的蛋白质稳定性。PY单一模序突变后TMEPAI介导c-Maf发生泛素化的能力显著减弱,但两个PY模序都突变后则完全丧失了对c-Maf的调控作用。5、c-Maf特异性响应单元介导的荧光素酶活性分析发现TMEPAI显著性减弱了c-Maf的转录活性。TM缺失后不能削弱TMEPAI对c-Maf的转录调控作用。6、利用包装的TMEPAI慢病毒侵染多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226和LP1发现TMEPAI可以促进内源性c-Maf的降解,进而诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡。结论本研究发现TMEPAI通过NEDD4调控c-Maf蛋白的泛素化降解,进而抑制了c-Maf的稳定性和转录活性,其中TMEPAI的PY模序(PY motif)及膜域(TM domain)在c-Maf蛋白的泛素化降解过程中均发挥重要作用。