微环境缺氧是大多数实体肿瘤的显著特征之一,对肿瘤的预后有明显影响,缺氧诱导因子1(Hypoxia inducible factor-1, HIF-1)是适应缺氧的主要转录因子和关键调控单位,通过多种机制促进肿瘤生存,尤其是细胞对化疗药物敏感性的变化,并有多种分子参与了该过程,成为了实体肿瘤患者化疗失败最重要的原因之一。由于其分子机制尚未完全阐明,并且存在细胞特异性,至今仍未发现行之有效的逆转方法。因此从分子机制阐明并寻找从缺氧发生到耐药表型形成过程中的主要分子十分重要。近年来,有研究称HIF-1可能是缺氧诱导实体瘤产生耐药和抗凋亡的一个上游关键分子。因此,探讨HIF-1在缺氧环境诱导结肠癌耐药及对抗凋亡的分子机制,将有助于全面深入阐明在缺氧微环境下肿瘤细胞的生物学表型变化,为今后的靶向治疗提供理论依据和分子靶点。目的:在细胞水平上观察CoCl2模拟缺氧条件下人结肠癌Lovo细胞的增殖和对化疗药物敏感性的变化,分子水平上研究多种耐药相关基因和凋亡相关蛋白的变化。探讨微环境缺氧对结肠癌化疗耐药的影响及相互作用,为今后结肠癌的治疗提供作用靶点。方法:本实验采用二氯化钴(CoCl2)建立缺氧模型,MTT法中细胞均用96孔板培养,用于RT-PCR,Western-blot和流式细胞分析的细胞均用6孔板培养。1利用MTT比色法检测不同程度缺氧条件对结肠癌Lovo细胞生长曲线的影响。2利用MTT比色法检测模拟缺氧条件下氟尿嘧啶(FU)对Lovo细胞的抑制率的影响,设对照孔和空白孔。3在含不同CoCl2浓度培养基作用相同时间后,利用RT-PCR检测HIF-1α、MDR1、MRP、BCRP和LRP基因的mRNA水平的变化,以β-actin作为内参照。4在含不同CoCl2浓度培养基处理相同时间后,利用Western-blot检测HIF-1α、Bcl-2、Bax和Bad蛋白水平的变化,以β-actin作为内参照。5利用流式细胞术(FCM)观察在常氧和模拟缺氧条件下结肠癌细胞系内阿霉素的蓄积和潴留变化,间接反应耐药基因的对化疗药物转运作用。结果:1用CoCl2模拟肿瘤体内缺氧微环境,采用MTT法测定细胞的生长曲线,结果发现随着CoCl2浓度增加,细胞对数生长期较对照组有所提前,生长速度减慢,尤其在250μmol/L时细胞生长则呈明显抑制状态。2肿瘤细胞在不同CoCl2浓度后,观察FU作用24h肿瘤生长抑制率的变化情况,发现在100μmol/L,150μmol/L和200μmol/L处理后的Lovo细胞对FU的敏感性下降,低于对照组,p<0.05。而在250μmol/L的浓度下抑制率却明显增加,高于未用对照组,p<0.05。3在不同CoCl2浓度梯度培养24h后观察HIF-1α及多种耐药基因mRNA转录水平变化。经RT-PCR分析,结果显示,相同作用时间下,随着CoCl2浓度的递增,HIF-1α和LRP的mRNA转录水平未见明显变化,而mdr-1,MRP和BCRP的转录逐渐增高,呈现出一定的剂量依赖性,p<0.05。4不同CoCl2浓度梯度处理24h后,观察HIF-1α及凋亡相关因子蛋白表达变化。western-bolt分析,结果显示,相同作用时间下,随着CoCl2浓度的递增,HIF-1α蛋白表达增高,而Bax和Bad的蛋白表达则逐渐减低,呈现剂量依赖性,Bcl-2表达无明显变化。Bcl-2与Bax的比值随CoCl2浓度的递增而降低。5利用FCM检测模拟缺氧和常氧下结肠癌Lovo细胞内阿霉素(ADR)蓄积和潴留变化水平。结果显示,与常氧组相比缺氧组中,一定时间内Lovo细胞中ADR的蓄积无明显变化,ADR潴留水平则显示缺氧组较常氧组明显减少。结论:1缺氧环境下人结肠癌Lovo细胞增殖水平降低;2在适度的缺氧条件下FU对结肠癌的抑制率降低,但缺氧增加到一定程度抑制率反而增加;3缺氧条件下结肠癌细胞通过两方面表现降低对化疗药物的敏感性,使肿瘤细胞凸显生存优势。①缺氧通过HIF-1a介导上调Mdr-1,MRP和BCRP基因表达而减少了化疗药物在细胞内的潴留水平;②通过下调Bax和Bad等促凋亡因子的表达而逃脱化疗药物诱导的凋亡。