背景:间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能,是骨缺损修复再生中理想的种子细胞,在口腔颌面部骨缺损及牙周组织再生修复治疗中有着重要的应用价值。间充质干细胞的分化命运受多种机制及微环境因素的调节。表观遗传调控机制是其中的重要方式。KDM7A是一种组蛋白去甲基化酶,有文献报道其可通过表观遗传调控方式参与棕色脂肪细胞分化,然而其对间充质干细胞成脂/成骨分化的调控作用未见报道。本研究拟探讨KDM7A对间充质干细胞成脂/成骨分化的作用及其可能的作用机理。方法:一、检测Kdm7a的组织分布qRT-PCR检测6周龄C57BL/6J小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、骨、骨骼肌、小肠、结肠、腹股沟脂肪、附睾脂肪、胃肠脂肪和肾周脂肪组织中Kdm7a的mRNA表达水平。二、Kdm7a调控间充质干细胞定向分化的功能研究1.qRT-PCR检测小鼠原代骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal StemCells,BMSCs)成脂分化过程中Kdm7a的mRNA表达水平,检测骨髓基质细胞系ST2细胞成脂/成骨分化过程中Kdm7a的mRNA表达水平。2.设计合成Kdm7a siRNA,抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,诱导成脂分化,通过油红O染色观察ST2细胞分化状态,qRT-PCR检测成脂分化相关转录因子PPARγ、C/EBPα和标志基因aP2、Adipsin的mRNA水平,Western blot方法检测检测PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白水平;诱导成骨分化,通过碱性磷酸酶染色观察ST2细胞分化状态,qRT-PCR检测成骨分化相关转录因子Runx2、Osterix和标志基因Osteocalcin、Alp、Bsp、Opn的mRNA表达水平,Western blot方法检测Runx2、Osterix和ALP蛋白表达水平。3.构建Kdm7a组蛋白去甲基化酶催化基团失活的突变型质粒,ST2细胞过表达野生型和突变型Kdm7a质粒,诱导成脂/成骨分化,通过油红O染色、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR和Western blot方法检测野生型和突变型Kdm7a质粒对ST2细胞成脂/成骨分化的作用。4.构建Kdm7a敲低慢病毒质粒,利用293T细胞包装Kdm7a敲低慢病毒颗粒,用其感染ST2细胞,诱导成脂/成骨分化,通过油红O染色、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR和Western blot方法检测Kdm7a敲低慢病毒对ST2细胞成脂/成骨分化的作用。5.Kdm7a敲低慢病毒感染小鼠原代BMSCs,诱导成脂/成骨分化,通过油红O染色、碱性磷酸酶染色和qRT-PCR方法检测Kdm7a敲低慢病毒对小鼠原代BMSCs成脂/成骨分化的作用。三、Kdm7a调控间充质干细胞定向分化的机制研究1.利用Kdm7a siRNA抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,未经诱导情况下,通过qRT-PCR检测成脂相关转录因子C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和成骨相关转录因子/标志基因Sfrp1、Klf7、Klf9的mRNA表达水平。2.利用Kdm7a siRNA抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,未经诱导情况下,通过染色质免疫共沉淀的方法,从DNA-蛋白质结合的水平检测C/EBPα和Sfrp1启动子区与KDM7A蛋白及双甲基化组蛋白H3K9me2、H3K27me2的结合。结果:一、Kdm7a的组织分布Kdm7a在所检测的小鼠不同组织中mRNA表达水平不同,其在小肠中的相对表达量最低,在骨中的相对表达量最高。二、Kdm7a调控间充质干细胞定向分化的功能研究1.Kdm7a在小鼠原代BMSCs成脂分化过程中的mRNA水平先上升后下降,在ST2细胞成脂/成骨分化过程中的mRNA水平亦先上升后下降。2.利用Kdm7a siRNA抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,与对照组比较,Kdm7a siRNA组脂肪细胞分化减少,成脂分化特异性因子PPARγ、C/EBPα、aP2和Adipsin的mRNA表达水平下降,PPARγ、C/EBPα和aP2的蛋白水平下降。3.利用Kdm7a siRNA抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,与对照组比较,Kdm7a siRNA组成骨分化能力增强,成骨分化特异性因子Runx2、Osterix、Osteocalcin、Alp、Bsp和Opn的mRNA表达增加,Runx2、Osterix和ALP的蛋白水平增加。4.ST2细胞过表达野生型和突变型Kdm7a质粒,与对照组比较,野生型Kdm7a促进脂肪细胞分化,成脂分化相关特异性因子的mRNA和蛋白表达增加;抑制成骨细胞分化,成骨分化相关特异性因子的mRNA表达水平降低。突变型Kdm7a丧失调控ST2细胞成脂/成骨分化的能力。5.Kdm7a敲低慢病毒抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,向脂肪细胞分化减少,成脂分化相关特异性因子的mRNA和蛋白表达减少;向成骨方向分化增加,成骨分化相关特异性因子的mRNA和蛋白表达增加。6.Kdm7a敲低慢病毒抑制小鼠原代BMSCs中Kdm7a的内源性表达,向脂肪细胞分化减少,成脂分化相关特异性因子的mRNA表达下降;向成骨方向分化增加,成骨分化相关特异性因子的mRNA表达水平上调。三、Kdm7a调控间充质干细胞定向分化的机制研究1.利用Kdm7a siRNA抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,未经诱导情况下C/EBPα和Sfrp1的mRNA表达显著减少。2.利用Kdm7a siRNA抑制ST2细胞中Kdm7a的内源性表达,未经诱导情况下,染色质免疫共沉淀结果表明,抑制ST2细胞中Kdm7a的表达后,与C/EBPα和Sfrp1启动子区结合的KDM7A蛋白减少,而双甲基化组蛋白H3K9me2、H3K27me2增加。结论:1.Kdm7a在C57BL/6J小鼠中的分布具有组织特异性。2.Kdm7a可能参与小鼠原代BMSCs和ST2细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化的过程。3.在体外,Kdm7a能够促进小鼠原代BMSCs和ST2细胞向脂肪细胞分化,抑制其向成骨方向分化。4.Kdm7a调控间充质干细胞成脂/成骨分化的作用可能与其去甲基化酶催化活性相关。5.KDM7A可能通过移除C/EBPα和Sfrp1启动子区的双甲基化组蛋白H3K9me2、H3K27me2的甲基化标记,激活C/EBPα和Sfrp1的表达,从而调控ST2细胞成脂/成骨分化。