阿尔茨海默病(AlzheimerDisease，AD)是一种以记忆减退、认知障碍、以及进入痴呆状态为特征的脑退行性疾病。其病理改变为大脑皮层和海马等脑区出现大量的老年斑(senileplaque,SP)、神经纤维缠结(Neurofibirilarytangle,NFT)以及神经元的大量丢失。β淀粉样蛋白(β-amyliod，Aβ)是老年斑的主要成份，越来越多的研究表明，Aβ的大量沉积是诱发AD主要病理改变和临床表现的关键因素之一。研究证实，Aβ以及人工合成的各种Aβ片断，如Aβ1-42和Aβ25-35，都可诱发细胞凋亡；近年来，本研究室及其他研究者的工作证实，一个更小的Aβ片段Aβ31-35也具有与完整肽链或Aβ25-35类似的神经毒作用，可能是Aβ肽链中最短的活性序列。 谷氨酸(Glu)是脑内主要的兴奋性递质,Glu受体可分为离子型谷氨酸受体(inotropicglutamatereceptors，iGluRs)和代谢型谷氨酸受体(metabotropicglutamatereceptors，mGluRs)。前者包括NMDA、AMPA及KA受体等离子通道结构，介导快速兴奋性突触传递；后者属G蛋白耦联受体家族，根据其氨基酸序列的同源性、信号转导机制和药理学特性的不同，将其分为三组：Ⅰ～Ⅲ组mGluRs。其中Ⅰ组包括mGluR1和mGluR5，主要通过活化PLC产生IP3和DG发挥生物学效应，前者通过引起胞内Ca2+释放引起细胞内Ca2+升高，后者通过激活PKC发挥作用。Ca2+升高形成的Ca2+信号在胞内可引发多种生物学效应，而Ca2+超载是病理情况下引起神经损伤的重要机制。因此，Ⅰ组mGluRs的生物学作用尤其是在病理情况下的作用备受关注，而现有报道却大相径庭，既有Ⅰ组mGluRs介导神经毒作用的报道，又有他们拮抗神经毒发挥保护作用的报道。此外，有关Ⅰ组mGluRs对Aβ31-35神经毒作用的影响未见报道。因此，本研究利用培养神经元致凋亡模型[Ca2+]i测定等技术观察Ⅰ组mGluRs对Aβ31-35致神经元凋亡作用的影响。 研究方法包括利用透射电镜、AnnexinV-PI双染流式细胞术(FCM)和TUNEL染色法检测培养皮层神经元凋亡，利用离子成像法观察培养皮层神经元[Ca2+]i的变化，利用酶联免疫法检测Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的活性。首先应用Ⅰ组mGluRs激动剂DHPG、特异性mGluR1拮抗剂CPCCOEt和特异性mGluR5拮抗剂MPEP，观察Ⅰ组mGluRs是否介导了Aβ31-35对原代培养皮层神经元的致凋亡作用，检测Aβ31-35诱导的细胞凋亡是否伴有钙超载，并通过测定凋亡过程caspase系统活性的改变，分析Aβ致凋亡和有关的拮抗剂，激动剂作用是否通过凋亡的外源性或内源性途径实现；并且应用PKC抑制剂BMI观察Ⅰ组mGluRs介导Aβ31-35的作用是否通过PKC信号通路。从而阐明Ⅰ组mGluRs在Aβ31-35致原代培养神经元毒性过程的作用，为深入了解Ⅰ组mGluRs的生物学作用及Aβ31-35的神经毒作用提供进一步的实验依据。 第一部分Ⅰ组mGluRs介导Aβ31-35诱导神经元凋亡的作用观察。本部分实验在Aβ31-35引起小鼠皮层神经元凋亡的基础上，观察Ⅰ组mGluRs激动剂DHPG和特异性mGluR1拮抗剂CPCCOEt和mGluR5拮抗剂MPEP对Aβ31-35致凋亡作用的影响。 第二部分Ⅰ组mGluRs对Aβ31-35诱导的神经元[Ca2+]i变化的作用观察。研究证实，[Ca2+]i升高在各种原因所致的细胞损伤包括细胞凋亡中发挥非常重要的作用。本实验室以往的观察及本研究前期的实验均证实，Aβ31-35可引起神经元凋亡，同时第一部分实验又证实Ⅰ组mGluRs介导了Aβ31-35的致凋亡作用。为证实Aβ31-35对培养皮层神经元[Ca2+]i的作用以及Ⅰ组mGluRs对Aβ31-35诱导的[Ca2+]i变化的影响，我们利用生后1天的大鼠原代培养皮层神经元，以Ca2+指示剂Fura-2作为[Ca2+]i的荧光探针，利用离子成像技术在培养的皮层神经元进行观察。并通过计算F340/F380值，定量反映[Ca2+]i变化的幅度和动态变化过程，以期证实：1)Aβ31-35对培养皮层神经元[Ca2+]i的作用；2)Ⅰ组mGluRs激活对培养皮层神经元[Ca2+]i的作用及机制探讨；3)Ⅰ组mGluRs激活对Aβ31-35所致皮层培养神经元[Ca2+]i变化的影响。 第三部分Ⅰ组mGluRs介导Aβ31-35诱导神经元凋亡的作用机制探讨。前两部分的研究结果显示，Aβ31-35可致培养皮层神经元凋亡及[Ca2+]i升高，同时证实利用DHPG激活Ⅰ组mGluRs可致神经元凋亡及[Ca2+]i升高，此外DHPG还具有增强Aβ31-35致神经元凋亡和升高[Ca2+]i的作用。又由于Ⅰ组mGluRs既可通过IP3引起Ca2+释放也可通过DG激活PKC发挥作用。因此，为探讨Ⅰ组mGluRs介导Aβ31-35神经毒性作用的机制，我们利用生后1天的大鼠原代培养皮层神经元，用AnnexinV-PI双染流式细胞术观察PKC抑制剂BMI对Ⅰ组mGluRs介导Aβ31-35致神经元凋亡作用的影响，同时检测Caspase-3,-8,-9的活性，以期证实PKC在Ⅰ组mGluRs介导Aβ31-35致培养神经元凋亡的作用途径(线粒体依赖和/或死亡受体介导的凋亡途径)。