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背景和目的：乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染与肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的发生密切相关，HBV感染者发生HCC的危险性是无HBV感染者的200多倍。但是，至今HBV导致肝硬化和肝癌的机制仍不十分清晰。乙肝病毒x(hepatitis B virus x protein，HBx)蛋白具有多种生物学功能，可与宿主细胞的多种蛋白相互作用，调控宿主细胞基因表达，进而影响宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化等，其对肝细胞周期与凋亡的影响是HBV致HCC发生的重要机制之一。HBV感染可激活多种信号通路并影响炎症相关基因，如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因，环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)基因和干扰素(IFN)等的表达。Cox是前列腺素(PGs)合成过程中的限速酶，可将花生四烯酸转变为PGH2。近年来研究发现，花生四烯酸代谢产物与肿瘤的发生有着密切的关系，HBV阳性的慢性肝炎、肝硬化和HCC患者肝组织中Cox-2的表达明显高于正常组织或癌旁正常组织，并且Cox-2与HBx蛋白促进肝癌转移作用有关，提示Cox-2的过度表达在HBV病毒致病过程中起一定作用。本研究拟探讨乙肝病毒X蛋白在人肝母细胞瘤(HepG2)细胞中对Cox-2表达的影响，并观察对细胞生长和细胞周期的作用，为进一步阐明乙肝病毒X蛋白在HBV致病过程中的作用机制提供一些实验依据。
实验方法：首先设计扩增HBV X蛋白的扩增引物；从HBV患者血清中PCR扩增得到HBx基因；纯化后与T载体(pGEM-T)连接，通用引物T7/SP6扩增鉴定克隆重组子，并进行测序分析，得到克隆重组子(pGEM-T-HBx)。BglII和EcoR I双酶切pGEM-T-HBx，回收双粘HBx基因片段，与表达载体pIRES2-AcGFP联接；用BglII和EcoR I双切鉴定亚克隆重组子pIRES2-AcGFP-HBx，并对pIRES2-AcGFP-HBx插入序列测序分析。脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染科HepG2细胞，G418筛选获得稳定转染细胞株。RT-PCR和Western-Blot检测HBx和Cox-2 mRNA和蛋白表达情况；萤光素酶报告基因系统检测HBx蛋白对Cox-2基因启动子的作用：MTT法、流式细胞术(FCM)分别测定细胞生长和细胞周期。
实验结果：
1.从HBV病人血清扩增得到465bp的HBx目的基因；T7/SP6扩增筛选得到克隆重组子(pGEM-T-HBx)；BglII和EcoR I双酶切鉴和测序证实亚克隆重组子pIRES2-AcGFP-HBx正确。
2.HBx mRNA和western blot检测结果显示：转染pIRES2-AcGFP-HBx的HBx蛋白表达组HepG2细胞中可见高水平的HBx mRNA和蛋白表达，HBx基因转染筛选成功。
3.HBx蛋白表达组(转染pIRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞)细胞Cox-2 mRNA的相对表达量为0.76±0.12，载体对照组(转染pIRES2-AcGFP的HepG2细胞)的相对表达量为0.28±0.04、空白对照组(未转染的HepG2细胞)的相对表达量为0.25±0.03；经统计学分析，HBx蛋白表达组细胞Cox-2mRNA的相对表达量显著高于载体对照组和空白对照组，差异有非常显著性(P<0.01)。
4.Cox-2蛋白免疫印迹结果显示：有HBx蛋白表达的HepG2细胞中Cox-2蛋白表达显著升高。
5.HBx蛋白表达组细胞Cox-2启动子萤光素酶荧光度值为1675.2±84.9，载体对照组的荧光度值为657.7±34.7、空白对照组的荧光度值为739.3±45.3；经统计学分析HBx蛋白表达组细胞Cox-2启动子萤光素酶荧光度值显著高于载体对照组和空白对照组，差异有显著性(P<0.05)。
6.HBx蛋白表达组细胞在3d、4d、5d生长显著加快，与载体对照组和空白对照组细胞MTT测定结果比较差异均有显著性(P<0.05)。
7.载体对照组与空载体对照组之间G0～G1期、G2～M期、S期比例，经统计学处理差异无显著性(P>0.05)。而HBx蛋白表达组与2个对照组比较，G0～G1期比例显著降低，S期和G2～M期比例显著增加，差性有显著性(P<0.05)。
结论：在HepG2细胞中，HBx蛋白对Cox-2启动子活性有显著提高作用，HBx蛋白可显著升高细胞中Cox-2蛋白表达水平：HBx蛋白可促进HepG2细胞分裂增殖、促进细胞生长。