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渔用疫苗接种因其可有效地预防水产动物疾病，又能避免抗生素等药物对水环境和水产品本身造成的污染，已成为国际上水产疫病防控的主流技术。免疫佐剂是指结构多样具有调节疫苗抗原固有免疫原性属性的物质。细胞因子是机体的自身成分，作为佐剂，相比传统佐剂具有更多优势。IL-8是由多种细胞产生具有趋化属性的细胞因子，它能促进局部的炎症反应，趋化T细胞和调节其细胞因子的产生。研究表明，IL-8作为细胞因子佐剂对疫苗具有免疫增强作用，可显著增强疫苗的免疫保护效力。本文以斑点叉尾鮰源IL-8作为细胞因子佐剂来验证其能否增强斑点叉尾鮰源海豚链球菌疫苗的免疫效力。具体内容包括: 1.斑点叉尾鮰IL-8基因的克隆及分子特性分析 采用RT-PCR法从斑点叉尾鮰脾脏中扩增出IL-8(CcIL-8)基因，并将CcIL-8片段克隆到pMD19-T载体中，构建重组质粒。应用生物信息学工具对该基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行分子特性分析。结果表明:CcIL-8全长336 bp，包含一个完整的开放阅读框，编码111个氨基酸，含有CXC型趋化因子保守结构域和信号肽;存在跨膜区;含有2个潜在的丝氨酸磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成;氨基酸序列分析表明本研究得到的是斑点叉尾鮰IL-8短的可变转录本，该氨基酸与印度囊鳃鲶（Heteropneustes fossils）IL-8氨基酸的一致性高达87.1％，进化树上聚为一簇，亲缘关系较近，与鲤鱼、斑马鱼和虹鳟等硬骨鱼类亲缘关系较远。 2.斑点叉尾鮰IL-8成熟肽基因的原核表达及其作为海豚链球菌亚单位疫苗免疫佐剂的效果评价 参照已克隆的CcIL-8序列设计去信号肽引物，克隆到斑点叉尾鮰成熟肽（mCcIL-8）基因，全长264 bp。将成熟肽基因与pET-32a(+)载体连接，构建原核表达载体pET-32a(+)-mCcIL-8，并于表达菌BL21(DE3)中诱导表达，成功表达大小约为29 kDa的重组斑点叉尾鮰IL-8成熟（重组mCcIL-8）蛋白。经过Ni-NTA亲和层析纯化以及梯度透析复性后，Western-blot和SDS-PAGE检测分别表明重组蛋白融合表达成功以及该蛋白已纯化为单一条带。为验证纯化复性的重组mCcIL-8(rmCcIL-8)蛋白是否具有免疫佐剂效应，将重组mCcIL-8蛋白(20μg/尾)与海豚链球菌亚单位疫苗S.iniae-rENO（50μg/尾）混合腹腔注射免疫斑点叉尾鮰（80±10 g），同时以重组mCcIL-8蛋白为蛋白佐剂对照组、S.iniae-rENO为疫苗对照组和PBS为阴性对照组。(1)血清非特异性免疫指标:于免疫后的第1、3、7、14、21、28和56 d采血液，收集血清，对斑点叉尾鮰血清中溶菌酶活力和ACH50活性这两个非特异性免疫指标进行测定。结果:与S.iniae-rENO组相比，S.iniae-rENO+rmCcIL-8组溶菌酶活力于免疫后第1、3和7d得到极显著(P＜0.01)增强，第14d时两疫苗组无显著差异，但均极显著(P＜0.01)高于蛋白佐剂对照组和阴性对照组，第21d后的各个时间点各组溶菌酶活力无显著差异;ACH50活性于免疫后第1和3d得到显著(P＜0.05)增强，第7和14d时两疫苗组无显著差异，但均极显著(P＜0.01)高于蛋白佐剂对照组和阴性对照组，第21d后的各个时间点各组ACH50活性无显著差异。表明:重组mCcIL-8蛋白能够在一定时间内增强亚单位疫苗S.iniae-rENO诱导的溶菌酶和ACH50水平。(2)血清ELISA抗体:于免疫后第7、14、21、28、35、42和56 d采血液，收集血清，采用间接ELISA法检测斑点叉尾鮰血清中抗rENO抗体水平。结果:在免疫后第14 d检测到疫苗组出现特异性抗体;S.iniae-rENO+rmCcIL-8组在第14d到42 d的抗体水平显著(P＜0.05)高于S.iniae-rENO组，并于第28 d达到峰值，第35 d抗体水平下降;第56 d疫苗组均未能检测到特异性抗体。表明:重组mCcIL-8蛋白能提高亚单位疫苗S.iniae-rENO的抗体水平，但是未能延长抗体产生的持续时间。(3)免疫相关基因的表达:于免疫后第28 d进行攻毒试验的24 h后收集疫苗组和阴性对照组的头肾组织，采用qRT-PCR检测各组试验鱼免疫相关基因的相对表达量。结果:S.iniae-rENO+rmCcIL-8组试验鱼的IL-1β、TNF-α、CXCL10和MHCⅡβ等基因的相对表达量显著(P＜0.05)高于S.iniae-rENO组。表明:重组mCcIL-8蛋白促使亚单位疫苗S.iniae-rENO产生更强的免疫反应和MHCⅡ类抗原提呈反应。(4)攻毒保护率:于免疫后第28和56 d分别进行攻毒试验，对两次攻毒后各组的死亡率及疫苗组的保护率进行统计。结果:第一次攻毒后，S.iniae-rENO+rmCcIL-8组的相对免疫保护率(71.42％)明显高于S.iniae-rENO组(49.99％)，但是第二次攻毒后，两种疫苗均无较好的免疫保护力。表明:亚单位疫苗S.iniae-rENO+rmCcIL-8能诱导鱼体产生更强的保护免疫力，重组mCcIL-8蛋白能增强亚单位疫苗S.iniae-rENO的免疫保护效力，但未能延长该疫苗的保护时间。 3.斑点叉尾鮰IL-8基因真核表达载体的构建及其作为海豚链球菌DNA疫苗免疫佐剂的效果评价 将含Kozak和6×CAC标签序列的CcIL-8(MCcIL-8)基因克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中，成功构建真核重组表达质粒pcDNA3.1(+)-MCcIL-8(pc-MCcIL-8)，从RNA水平上，通过RT-PCR法检测到肌肉注射pc-MCcIL-8的第7、14、28和56 d后均有MCcIL-8基因的转录;从蛋白质水平上，通过免疫组织化学检测到MCcIL-8蛋白在斑点叉尾鮰肌肉组织中的表达。为验证pc-MCcIL-8质粒DNA是否具有免疫佐剂效应，将pc-MCcIL-8(25μg/尾)与海豚链球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)S.iniae-eno(pc-Sieno，25μg/尾)混合肌肉注射免疫斑点叉尾鮰(80±10g)，同时设基因佐剂对照组pc-MCcIL-8、DNA疫苗对照组pc-Sieno和空载体对照组pcDNA3.1(+)(pc)。(1)血清非特异性免疫指标:于免疫后第1、3、7、14、21、28和56 d采血液，收集血清，对斑点叉尾鮰血清中溶菌酶活力和ACH50活性这两个非特异性免疫指标进行检测。结果:pc-Sieno+pc-MCcIL-8组溶菌酶活力于免疫后第3～56 d均显著(P＜0.05)高于pc-Sieno组，并于第21 d达到峰值;ACH50活性于免疫后第3～56 d均极显著(P＜0.01)高于pc-Sieno组，并于第14d达到峰值。表明:pc-MCcIL-8能增强DNA疫苗pc-Sieno刺激鱼体产生溶菌酶和ACH50的水平;(2)血清ELISA抗体:于免疫后第7、14、21、28、35、42和56 d采血液，收集血清，采用间接ELISA法检测斑点叉尾鮰血清中抗ENO抗体水平。结果:在免疫后第14～56 d各个时间点，pc-Sieno+pc-MCcIL-8组抗体水平极显著(P＜0.01)高于pc-Sieno组，并于第35 d达到峰值。表明:pc-MCcIL-8能明显提高DNA疫苗pc-Sieno刺激斑点叉尾鮰产生的抗体水平。(3)免疫相关基因的表达:于免疫后第28 d进行攻毒试验的24 h后收集疫苗组和空载体对照组的头肾组织，qRT-PCR检测各组试验鱼免疫相关基因的相对表达量。结果:pc-MCcIL-8能促进DNA疫苗极显著(P＜0.01)上调IL-1β和CXCL10以及显著(P＜0.05)上调TNF-α和MHCⅡβ的相对表达量。表明:pc-MCcIL-8可能通过诱导IL-1β和TNF-α等细胞因子的分泌促进免疫反应以及增强MHCⅡ类抗原提呈反应而发挥佐剂效应;(4)攻毒保护率:于免疫后第28和56 d分别进行攻毒试验，对两次攻毒后各组的死亡率及疫苗组的保护率进行统计。结果:pc-Sieno+pc-MCcIL-8组（80％和73.33％）两次攻毒的相对免疫保护率均明显高于pc-Sieno组（60％和53.33％）。表明:pc-Sieno+pc-MCcIL-8疫苗能诱导鱼体产生更强的保护免疫力，而且持续时间长达两个月。