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牛支原体是引起牛呼吸道疾病的主要病原体之一。近年来,它在全世界范围内流行,给养牛业造成了严重的经济损失。本研究旨在建立一种现场快速检测牛支原体的方法—重组酶聚合酶扩增(RPA),为牛支原体疾病的现场诊断提供技术支持。以牛支原体oppD/F、p80基因为靶基因设计引物和探针,筛选出了以p80基因(GenBank accession number:NZ_LQDV01000064.1)为靶标的1对引物和探针,建立了检测牛支原体的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测方法,RPA反应可在25-40℃下、10-25 min内完成,最佳反应条件为37℃下反应10 min;该方法特异性好,与其他受试支原体和细菌病原无交叉反应。将RPA与侧向流(LF)试纸条组成LF-RPA检测试剂,其敏感性较高,最低可检测基因组DNA 5 pg/μL或对照质粒38.9拷贝/μL,对192份临床样品DNA进行检测,与qPCR检测结果符合率为93.75%。建立的牛支原体LF-RPA方法无需实验室条件,适合于兽医临床现场检测。提取基因组DNA是核酸检测方法的关键性技术环节之一,提取效率和质量直接影响检测方法的灵敏度。以牛支原体培养物为研究对象,以实验室常用的细菌基因组提取试剂盒为标准方法对照,评估了拟用于临床样品DNA提取的两种方法萃取试剂盒和煮沸法对牛支原体核酸的提取效果,结果萃取试剂盒和煮沸法提取的DNA均有不同程度的RNA或蛋白质污染。将两种方法提取的DNA与三种核酸检测方法进行了适应性研究,结果煮沸法DNA的被检出下限分别是:LF-RPA(49 CFU)>PCR(4.9×10~2 CFU)>qPCR(4.9×10~4 CFU);萃取试剂盒DNA的被检出下限分别是:LF-RPA(4.9×10~3 CFU)>PCR(4.9×10~4 CFU)>qPCR(4.9×10~5 CFU)。表明萃取试剂盒和煮沸法提取的DNA对PCR/qPCR检测具有一定的干扰,但适合于LF-RPA检测。进一步用模拟临床样品对萃取试剂盒和煮沸法提取临床样品DNA的效果进行评估,结果对奶样来说,萃取试剂盒提取的DNA其检测效果(检测限PCR为5×10~3 CFU,LF-RPA为50 CFU)要高于煮沸法(检测限PCR为5×10~6 CFU,LF-RPA为5×10~4 CFU);对鼻拭子来说,煮沸法提取的DNA(检测限PCR为500 CFU,LF-RPA为5 CFU)要优于萃取试剂盒(检测限PCR为5×10~7CFU,LF-RPA为5×10~4CFU);对肺组织来说,萃取试剂盒(检测限PCR为5×10~3 CFU,LF-RPA为5×10~3 CFU)要优于煮沸法(检测限PCR无法检出,LF-RPA为5×10~7 CFU)。表明不同类型的临床样品适应于不同的DNA提取方法。其中,奶样和肺组织样品适合于萃取试剂盒,鼻拭子适合于煮沸法。组合适宜的临床样品处理方法以及建立的LF-RPA方法,应用于120份临床样品检测,结果阳性率为24.1%,与实验室qPCR检测方法的符合率达95%。本文建立了一种适合于临床现场检测牛支原体核酸的快速检测方法,包括临床样品的处理、RPA检测和LF试纸条可视化读取结果等全过程,为牛支原体病现场诊断提供了技术支持。