背景与目的急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia,AML)是一类恶性克隆性异质性疾病,具有病情凶险,病死率高,易复发的特点。大量的研究表明患者体内残留的白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)是白血病耐药和复发的根源,因此清除LSC成为根治AML的关键。目前关于LSC的来源仍没有明确的结论,但比较公认的说法是LSC源自于HSC的基因突变。近年来,AML的治疗已取得较大进步,其治疗方法主要是化疗和异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),但有大量患者仍然会复发。复发的原因主要是LSC对常规化疗药物耐药,残留的LSC具有自我更新、增殖及分化功能,产生白血病细胞,从而导致AML患者复发。Allo-HSCT是治愈AML的重要方法,同种异体反应性NK细胞(allo-NK)在移植物抗白血病效应中起关键作用,但具有药物抵抗和allo-NK细胞抵抗的LSC导致的移植后复发仍是AML治疗的难点,因此研究NK细胞对LSC的免疫作用对治疗AML具有重要的作用。Allo-NK细胞作为固有免疫系统的重要成分,具有识别正常和异常组织细胞的能力,其表面表达活化性受体(KAR)和抑制性受体(KIR),一般情况下,正常组织细胞上杀伤细胞抑制性信号占主导地位,故NK细胞不会杀伤正常组织,避免了自身免疫性疾病的发生,然而肿瘤细胞由于失去KIR的抑制作用,使活化性受体KAR占主导地位,活化性受体DNAM-1和NKG2D与肿瘤细胞表面免疫激活物(配体)结合后,激活NK细胞,一方面,NK细胞分泌穿孔素和颗粒酶等直接使肿瘤细胞溶解破坏,另一方面,NK细胞表达的TRAIL和FasL能够与肿瘤细胞表面死亡受体DR4/5和Fas结合,诱导肿瘤细胞通过外源性凋亡途径凋亡。其中,活化性受体NKG2D与其配体MHC样分子(MHC class Ⅰ chain related A and B,MICA/B)、UL16结合蛋白家族成员(UL16-binding protein 1-3,ULBP1-3),构成抗肿瘤免疫监视的重要信号途径。allo-NK细胞对白血病细胞的杀伤活性受NKG2D配体表达水平的影响。白血病细胞通过不表达或低表达NKG2D配体逃逸机体的免疫监视,我们前期研究也发现LSC低表达NKG2D配体,LSC可能通过改变NK细胞受体的配体表达水平逃避免疫活性细胞的识别从而逃逸机体的免疫监视。因此,有可能通过调节免疫激活物在LSC的表达增强免疫细胞的抗肿瘤作用,这对清除LSC有重要的意义。研究表明,LSC存在多个信号转导系统异常激活,其中RAS信号通路在凋亡抵抗及逃逸免疫治疗中起重要作用。RAS是ras原癌基因的蛋白产物。细胞浆前体形式的RAS须经法尼基化修饰才能定位于细胞膜内侧,从而传导酪氨酸激酶的有丝分裂信号。RAS信号通路不但可通过激活PI3K/AKT促使LSC抵抗凋亡,也可能促使LSC下调NKG2D配体表达抵抗NK细胞的杀伤逃逸免疫治疗。有研究发现激活ras基因及DNA甲基转移酶的活性与NKG2D表达降低相关。手霉素(Manumycin)具有抑制法尼基转移酶的作用,其治疗肿瘤是基于RAS癌基因及相关信号通路的研究。手霉素酰胺侧链与法尼基焦磷酸酯的异戊二烯基团类似,与法尼基焦磷酸酯竞争性结合法尼基转移酶,可以阻断RAS相关的促有丝分裂作用,从而能诱导肿瘤细胞的凋亡,因此我们设想手霉素与免疫调节作用相关,通过测定手霉素处理前后LSC细胞活性变化、手霉素对LSC被NK细胞杀伤敏感性的影响、对NK细胞诱导LSC凋亡的影响以及检测手霉素对LSC表达免疫激活物(NKG2DL)及相关凋亡蛋白的影响,探讨手霉素免疫增敏的作用及机制。方法第一章手霉素增强NK细胞对LSC的杀伤及凋亡1.CD34+CD38-LSC的分选及纯度检测；分离纯化allo-NK细胞；CCK-8实验方法检测不同浓度手霉素对LSC的细胞毒性；LDH法检测NK细胞(NK-92细胞及allo-NK细胞)对LSC的杀伤作用；流式细胞术检测allo-NK细胞诱导LSC凋亡。2.实验数据采用SPSS20.0软件进行分析,以均数±标准差(X±s)表示。两组比较采用独立样本t检验进行分析,多组比较采用单因素方差分析进行分析,不同效靶比间NK-92/allo-NK细胞的杀伤活性比较采用析因设计方差分析进行分析；P<0.05表示差异有统计学意义。第二章手霉素增强NK细胞对LSC的杀伤及凋亡相关机制1.流式细胞术检测手霉素干预前后LSC及阳性对照K562细胞表面NKG2D配体MICA/B和ULBP1-3的表达；Western-blot法检测手霉素对LSC内源性及外源性凋亡途径关键蛋白分子的影响；2.实验数据采用SPSS 20.0软件进行分析,以均数±标准差(X±s)表示。K562细胞与LSC表面NKG2D配体表达、手霉素处理前后LSC细胞表面NKG2D配体表达均采用独立样本t检验；P<0.05表示差异有统计学意义。结果第一章手霉素增强NK细胞对LSC的杀伤及凋亡1.CD34+CD38-LSC的分选及纯度检测采用免疫磁珠分选(负选)方法从KGla细胞株中分选CD34+CD38-LSC细胞,流式细胞术检测分选细胞表面CD34+CD38-抗原表达率为99.98%。2.分离纯化allo-NK细胞的形态健康志愿者外周血分离出的PBMC,经Human rlL-2、Human rIL-15诱导刺激的第二天即开始分裂增殖,细胞生长较快,allo-NK细胞体积较小,圆形透亮,呈团簇状生长。3.手霉素对LSC的毒性不同浓度的手霉素处理LSC 24 h后,发现手霉素对于LSC具有细胞毒性,且毒性呈剂量依赖性,随着手霉素浓度的升高,对LSC的生存抑制作用越强。当手霉素浓度达到4umol/1时,LSC达到半数抑制,即IC50为4umol/l。4.手霉素对NK细胞杀伤LSC的影响LDH法检测结果显示,与对NK-92细胞杀伤敏感的K562细胞相比,LSC对NK-92细胞的杀伤敏感性低,在效靶比为5：1、10：1、20：1时,NK-92细胞株对K562细胞和LSC的杀伤率分别为：(47.00±4.31% Vs24.08±1.23%、53.58±3.09% Vs27.91±2.11%、67.97±3.09% Vs 34.8±4.12%),两组细胞在不同效靶比间的被杀伤率比较差异均有统计学意义(F=4.055,P<0.05)。同样地,与对allo-NK细胞杀伤敏感的K562细胞相比,LSC对allo-NK细胞的杀伤敏感性也较低,在效靶比为5：1、10：1、20：1时allo-NK细胞对K562细胞和LSC的杀伤率分别为： (43.38±1.83% Vs24.05±3.61%、66.80±1.58% Vs28.40±3.24%、73.99±4.17% Vs35.07±2.58%),两组细胞在不同效靶比间的被杀伤率比较差异有统计学意义(F=20.947,P<0.05)。手霉素4umol/1处理LSC 24 h后,LSC被NK-92细胞的杀伤敏感性明显增强,且随着效靶比的增加而增强,在效靶比为5：1、10：1、20：1时分别为(47.53±3.35% Vs24.08±1.23%、62.78±2.70% Vs27.91±2.11%、72.65±3.38% Vs34.89±4.12%),差异有统计学意义(F=9.704,P0.05); LSC被allo-NK细胞的杀伤敏感性也明显增强,且随着效靶比的增加而增强,在效靶比为5：1、10：1、20：1时分别为(71.51±2.94% Vs24.05±3.61%、89.47±1.07% Vs28.40±3.24%、93.47±0.90%Vs 35.07±2.58%),差异有统计学意义(F=11.456,P<0.05)。5.手霉素增强allo-NK细胞诱导LSC凋亡流式检测结果显示,手霉素处理组相比于对照组而言,凋亡率升高,8.16±0.36%Vs 1.19±0.37%,两组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05)。在效靶比为10：1时allo-NK细胞诱导LSC的凋亡率为4.13±0.33%,而手霉素4umol/1处理LSC 24 h后,allo-NK细胞诱导LSC的凋亡率是11.38±0.47%,明显增高,比较差异有统计学意义(P<0.05),表明手霉素可增强allo-NK细胞诱导LSC的凋亡。第二章手霉素增强NK细胞对LSC的杀伤及凋亡相关机制1.手霉素上调LSC表面NKG2D配体表达LSC表面NKG2D配体MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达明显低于对NK细胞敏感的K562细胞,比较差异有统计学意义(P<0.05),提示LSC对NK细胞杀伤不敏感可能与NKG2D配体低表达有关,手霉素可能通过上调NKG2D配体增强NK细胞杀伤LSC。结果显示手霉素4 umol/1处理LSC 24 h后,LSC表面NKG2D配体的表达增加,MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3分别为(8.38±0.12% Vs0.62±0.26%、12.94±3.16% Vs0.33±0.15%、9.24±0.96%Vs0.83±0.15%、43.03±2.65% Vs0.66±0.44%),比较差异有统计学意义(P<0.05),表明手霉素可上调LSC表面NKG2D配体的表达。2.手霉素对LSC凋亡途径相关蛋白的影响手霉素干预LSC Oh,6h,12h,18h,24h后,提取蛋白,测定蛋白浓度,免疫印迹法检测内外源性凋亡途径关键分子的变化。结果显示：外源性凋亡途径中,Fas随干预时间的延长而逐渐表达增加,pro-caspase8逐渐减少,说明手霉素能够上调Fas蛋白表达,活化pro-caspase8,促进LSC外源性凋亡途径；线粒体凋亡途径中,pro-caspase9和pro-caspase3逐渐减少,pro-PARP在18h左右开始明显减少,蛋白表达降低,说明手霉素可能影响LSC内源性凋亡途径即线粒体途径；Bcl-2家族关键蛋白的变化：抑凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2随时间延长都逐渐减少,促凋亡蛋白Bax随时间变化没有改变。结论1.手霉素对LSC具有细胞毒作用；2.LSC对NK-92细胞及allo-NK细胞抵抗,手霉素可增强LSC被NK-92细胞及allo-NK细胞的杀伤敏感性；3.手霉素可上调LSC表面NKG2D配体的表达增强LSC被NK-92细胞及allo-NK细胞杀伤的敏感性；4.手霉素增强LSC被NK-92细胞及allo-NK细胞杀伤的敏感性可能与其上调外源性凋亡通路关键分子Fas和下调Bcl-xl和Bcl-2,激活线粒体凋亡途径有关。