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膀胱肿瘤是人类最常见的肿瘤之一,也是威胁人类健康导致人类死亡的重要原因之一。局限性的膀胱肿瘤对于人体的健康影响还是比较有限,但是膀胱肿瘤的快速生长导致的营养消耗,以及邻近组织的侵犯以及远处转移最终导致了患者的死亡。目前膀胱肿瘤的治疗手段是以手术治疗手段为主,辅助以放化疗及免疫调节治疗,但其治疗效果不能令人满意。寻求新的治疗成为目前膀胱肿瘤的预防与治疗的新思路,基因治疗成为目前的研究热点之一。TRPV2离子通道被证实可能与膀胱肿瘤的发生发展有密切关系,为此本实验为了探讨TRPV2对于膀胱肿瘤细胞株的体外影响,从而明确TRPV2基因作为膀胱肿瘤治疗的靶点的可能性。本实验分为三个部分：(1)TRPV2在膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞株中的表达；(2)大鼠TRPV2真核表达载体的构建和鉴定；(3)TRPV2对5637、EJ细胞增殖和迁移的影响的研究。第一部分：TRPV2在膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞中的表达目的：检测TRPV2在膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞中的表达。方法：常规细胞培养后,提取膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞的总RNA和总蛋白,分别通过RT-PCR和western blot检测TRPV2在上述细胞中的mRNA和蛋白水平的表达。结果：5637,T24,EJ细胞RT-PCR和western blot在目的位置都检测到对应的条带,并且转录和翻译水平的条带辉度基本一致。T24、EJ细胞的条带辉度值明显高于5637细胞的辉度值。结论：膀胱肿瘤细胞株5637,T24及EJ细胞的TRPV2在mRNA和蛋白水平都有表达。TRPV2在恶性度较高分化较差的膀胱肿瘤细胞株中表达量较高,而在分化相对较好恶性程度低的膀胱肿瘤细胞株的表达量较低。第二部分：大鼠TRPV2真核表达载体的构建和鉴定目的：构建含全长基因的TRPV2真核表达载体质粒。方法：根据基因文库GenBank数据库中提供的大鼠源性的TRPV2的mRNA序列,设计全长目的序列的引物,通过双酶切将产物连入pcDNA3.1+质粒,构建重组质粒。基因测序鉴定重组质粒的碱基序列,和数据库提供的目的基因序列比对。结果：酶切和基因测序表明获得了和预期大小一致,序列相同的基因片段,碱基序列通过测序和比对和基因文库提供的碱基序列一致。结论：成功构建基于真核表达载体pcDNA3.1+重组质粒。第三部分：TRPV2对膀胱肿瘤细胞株5637和EJ细胞增殖及迁移侵袭的影响目的：探讨TRPV2离子通道对膀胱肿瘤细胞株5637和EJ细胞增殖及迁移侵袭的影响。方法：分别将人膀胱癌EJ细胞株常规分为空白质粒对照组、正常细胞阴性对照组和sh-RNA干扰组；5637细胞组分为空白质粒对照组,正常细胞阴性对照组和TRPV2过表达质粒转染组进行实验。用lipofectamine2000介导针对TRPV2的sh-RNA转染EJ细胞,过表达TRPV2质粒转染5637细胞。经细胞筛选出单克隆阳性细胞后,采用Western blot检测TRPV2蛋白表达的变化鉴定基因的转染效率。流式细胞仪检测上述细胞生长周期,MTT法检测细胞生长曲线,划痕法检测细胞迁移侵袭能力,transwell法检测细胞的浸润能力。结果：成功转染并且筛选出sh-RNA干扰TRPV2的EJ细胞和TRPV2转染的5637重组细胞。细胞仪分析检测发现经过干扰TRPV2后的EJ细胞的细胞周期的G1期(63.21%±5.6%)明显高于正常细胞组(47.34%±4.43%)和空质粒转染组细胞(49.3±4.86%)(P<0.05),差异有统计学意义。而细胞生长曲线结果显示三组不同处理的EJ细胞数目在第3天开始出现差异,发现含干扰质粒的细胞组的OD显著低于空白质粒组和正常细胞组的测量值(P<0.05)。而流失细胞术细胞周期分析TRPV2转染的5637细胞(60.36±5.89%)；空质粒转染的5637细胞(57.32±5.89%)；正常的5637细胞(59.04±3.72%),无明显的统计学差异(P>0.05)。三种细胞的一周内的生长曲线也无明显差异。划痕实验结果证实sh-RNA-TRPV2组的EJ细胞的迁移能力明显低于正常细胞组和空白质粒转染组(P<0.05),而过表达TRPV2质粒组转染的5637迁移能力明显高于正常细胞组和空白质粒转染组(P<0.05)。Transwell结果发现sh-RNA-TRPV2组的EJ细胞的穿膜细胞数(55.5±9.75)明显少于于正常细胞组(102.2±8.74)和空白质粒转染组(108.5±11.89)(P<0.05),而过表达TRPV2质粒组转染的5637穿膜细胞数(86.31±7.043)明显多于正常细胞组(53.22±4.944)和空白质粒转染组(50.59±5.906)(P<0.05)。结论：sh-RNA干扰EJ细胞中的TRPV2表达后,可以抑制EJ细胞的生长增殖速度,并且同时可以抑制EJ细胞的迁移浸润能力,降低细胞的恶性程度。TRPV2过表达的质粒转染5637细胞后,对于5637细胞的生长和增殖速度无明显的影响。但是可以加强5637细胞的迁移和浸润能力,提高细胞的恶性程度。TRPV2可能是膀胱肿瘤的治疗的靶基因位点。